食品毒理學(xué)第七章化學(xué)毒物的生殖毒性

1、一、雄性生殖細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程,精子的發(fā)生過(guò)程是指精原細(xì)胞發(fā)育成為成熟精子的過(guò)程。精子的發(fā)生過(guò)程始于胎兒期的原始生殖細(xì)胞。出生后，原始生殖細(xì)胞分化成精原細(xì)胞，后者直至青春期以前再曲細(xì)精管中處于休止?fàn)顟B(tài)。在青春期，在腦垂體促性腺激素的作用下，開始增殖，進(jìn)行有絲分裂，形成兩個(gè)單倍體的次級(jí)精母細(xì)胞，再經(jīng)第二次成熟分裂，形成四個(gè)單倍體的精子細(xì)胞，精子細(xì)胞再經(jīng)過(guò)一系列形態(tài)學(xué)變化成為具有特殊形態(tài)的成熟精子。隨后由間質(zhì)細(xì)胞包裹釋放入輸精管內(nèi)，移入附睪后進(jìn)

2、一步成熟，成為具有受精能力和活動(dòng)力的精子，進(jìn)入精囊并在此貯存?！　【影l(fā)生過(guò)程是在神經(jīng)內(nèi)分泌的精密調(diào)控下進(jìn)行的。,第一節(jié) 雄性生殖毒性,一、雄性生殖細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程,表7-1 外源化學(xué)物作用時(shí)間與精子發(fā)育階段,（一）對(duì)睪丸生精細(xì)胞的影響,1.棉酚 　　長(zhǎng)期食用粗制棉子油－睪丸生精上皮丟失－睪丸內(nèi)精子、精細(xì)胞和精母細(xì)胞受損－精子細(xì)胞的頂體腫脹、分離與碎裂－精子中段的線粒體螺旋鞘排列紊亂、嵴目減少－通過(guò)葡萄糖和果糖代謝障礙抑制精子

3、活力－精子減少、不育2.工業(yè)污染物二硫化碳－睪丸損害、精子生產(chǎn)障礙3.鉛、鎘、汞、錳等重金屬－精子減少4.多種農(nóng)藥－精子減少、畸形、性功能減退,二、外源化學(xué)物的雄性生殖毒性,（二）對(duì)內(nèi)分泌功能的影響,睪丸的功能受垂體前葉分泌的促性腺激素的調(diào)節(jié)，而垂體分泌的促性腺激素又受下丘腦產(chǎn)生的促性腺釋放激素的調(diào)節(jié)。精子的生成是在神經(jīng)分泌的精密調(diào)節(jié)和控制下進(jìn)行?！　≈亟饘巽U可干擾下丘腦－垂體－睪丸軸的正常功能，主要是影響促性腺釋放激

4、素（GnRH）的釋放，表現(xiàn)為卵泡刺激素（FSH）、黃體生成激素（LH）、睪酮含量降低。最終造成精子減少，活力減弱，性欲減退等。二硫化碳亦可導(dǎo)致睪酮減少、精子生成障礙等。,（三）對(duì)性功能和生殖功能的影響,外源化學(xué)物（化學(xué)毒物）如果造成生殖系統(tǒng)任何一個(gè)環(huán)節(jié)的異常，則表現(xiàn)出雄性不育，即雄性性功能障礙。如鉛、鎘、汞、錳等重金屬。,（一）精子生成分析,（1）精子計(jì)數(shù)－數(shù)目減少量－確定有無(wú)毒害作用發(fā)生（2）精子形態(tài)觀察－頭尾部的形態(tài)改變

5、（3）精子狀態(tài)分析試驗(yàn)－靜夜的pH、液化時(shí)間，精子運(yùn)動(dòng)能力，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和微量元素的含量等－是否與外源化學(xué)物有關(guān),三、雄性生殖毒性的檢測(cè)方法,（二）精子穿透試驗(yàn),即精子體外受精實(shí)驗(yàn)，是檢測(cè)精子在體外能否成功穿透去透明帶的金黃地鼠卵子而受精的試驗(yàn)，為綜合評(píng)價(jià)外源化學(xué)物對(duì)人類精子受精能力的影響、探明雄性不育提供科學(xué)依據(jù)。,（三）睪丸中標(biāo)志酶活性的測(cè)定,臨床和動(dòng)物試驗(yàn)中常檢測(cè)乳酸脫氫酶同工酶x、山梨醇脫氫酶、6－磷酸葡萄糖脫氫酶的

6、變化，并結(jié)合精子生成過(guò)程中各階段細(xì)胞的功能和形態(tài)學(xué)改變，即可評(píng)價(jià)外源化學(xué)物的生殖毒性，并有可能探明毒性作用部位和機(jī)理。,（四）體外試驗(yàn),體外試驗(yàn)主要是將哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并與受試外源化學(xué)物接觸，觀察生殖細(xì)胞的變化?！　⊥ㄟ^(guò)支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等體外分離培養(yǎng)，測(cè)定支持細(xì)胞的乳酸含量和乳酸脫氫酶活性的變化以及測(cè)定間質(zhì)細(xì)胞分泌的雄激素含量來(lái)判斷外源化學(xué)物是否對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞的功能有影響?！　∫嗫煞蛛x上述細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和

7、形態(tài)學(xué)檢查的方法來(lái)判斷。,（五）雄性激素檢測(cè),雄性生殖系統(tǒng)無(wú)論生精過(guò)程、精子成熟過(guò)程，還是附屬性腺的分泌活動(dòng)，都需要有足夠的睪酮，通過(guò)檢測(cè)FSH、LH和睪酮的含量變化來(lái)判斷外源化學(xué)物是否對(duì)雄性生殖產(chǎn)生影響。檢測(cè)上述三種性激素含量有助于生殖毒性的評(píng)價(jià)以及生殖毒作用機(jī)制的探討。,（六）顯性致死試驗(yàn),顯性致死試驗(yàn)是通過(guò)給予雄性動(dòng)物受試化學(xué)物，將其與未經(jīng)受試物處理的雌性動(dòng)物交配，觀察雌性動(dòng)物早期胚胎死亡情況，以評(píng)價(jià)受試物是否對(duì)雄性動(dòng)物的生殖有損

8、害作用的試驗(yàn)?！　”痉椒ㄏ挡捎貌溉閯?dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，較接近人體實(shí)際情況，主要觀察指標(biāo)為胚胎早期死亡，即觀察子宮中活胎、死胎及吸收胎等書目，易于觀察，實(shí)驗(yàn)技術(shù)容易掌握，不需要復(fù)雜的試驗(yàn)條件。缺點(diǎn)是不夠靈敏。,（七）雄性生殖細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè),傳統(tǒng)檢測(cè)方法：小鼠睪丸染色體畸變分析試驗(yàn)、小鼠精子畸變分析試驗(yàn)、黑腹果蠅染色體性陰性分析試驗(yàn)　　新方法：?jiǎn)渭?xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（彗星試驗(yàn)）　　原理：細(xì)胞在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中受化學(xué)物作用后，DNA鏈發(fā)生斷裂。

9、將細(xì)胞制成單細(xì)胞混懸液，在載玻片上制備加有受檢細(xì)胞混懸液的凝膠，載堿性條件下使細(xì)胞裂解，解旋DNA后進(jìn)行電泳。帶負(fù)電荷的DNA斷裂端由陰極向陽(yáng)極遷移。DNA經(jīng)EB染色后在熒光顯微鏡下可觀察到DNA受損的細(xì)胞核拖一條尾巴，呈彗星狀，如DNA無(wú)損傷則見圓形的核。,（八）雄性生殖毒性病理檢查,睪丸、附睪、前列腺已經(jīng)精囊的重量和大小的改變常是接觸有害化學(xué)物的明顯特征。睪丸組織易受外來(lái)化學(xué)毒物的侵害，因此在亞慢性或慢性動(dòng)物毒性試驗(yàn)中，睪丸組織形

10、態(tài)檢查是一項(xiàng)重要的觀察指標(biāo)?！　〗馄视^察是生殖病理檢驗(yàn)的主要環(huán)節(jié)，是雄性生殖毒理學(xué)研究中不可缺少的較為敏感的指標(biāo)和重要手段。,一、雌性生殖細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程,雌性生殖系統(tǒng)由卵巢、輸卵管、子宮和外生殖器等組成。　　卵泡（包括卵細(xì)胞、包裹的顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞）的發(fā)育是一個(gè)連續(xù)變化的過(guò)程，一般可分為原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和成熟卵泡四個(gè)階段?！　÷殉驳闹芷谛宰兓齽?dòng)情周期密切相關(guān)?！　〕跫?jí)卵母細(xì)胞進(jìn)一步成熟并發(fā)育至次級(jí)卵母細(xì)胞，

11、需垂體下葉分泌的FSH和LH的作用。,第二節(jié) 雌性生殖毒性,（一）對(duì)卵細(xì)胞的影響,研究表明，卵細(xì)胞發(fā)育到排卵前階段即第一次減數(shù)分裂的終變期和中期對(duì)化學(xué)毒物最敏感?！　∪珂k，NIH雌性小鼠皮下一次注射氯化鎘1、3、6mg/kg后，排卵能力明顯受抑制，排卵數(shù)目隨劑量增加而減少，呈明顯的劑量－反應(yīng)關(guān)系。鎘可能直接進(jìn)入到卵細(xì)胞內(nèi)并損傷其遺傳物質(zhì)。鎘－－金屬硫蛋白中Zn2+　　二硫化碳不僅對(duì)多種動(dòng)物的睪丸有毒性作用，而且對(duì)雌性動(dòng)物

12、性腺、胚胎也有損害作用，可影響卵巢，使動(dòng)物的動(dòng)情周期發(fā)生改變，受孕能力降低，影響受精卵和胚胎的正常發(fā)育?！?二、外源化學(xué)物的雌性生殖毒性,（二）對(duì)內(nèi)分泌功能的影響,卵巢的功能和生殖周期受體內(nèi)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，即通過(guò)下丘腦－垂體－性腺軸。外源化學(xué)物可影響上述任何一個(gè)環(huán)節(jié)而對(duì)雌性生殖產(chǎn)生損害作用?！　”郊捌渫滴镌谝欢▌┝肯聲?huì)造成雌性的生殖功能損害，該類化學(xué)物直接干擾下丘腦，作用于垂體－卵巢系統(tǒng)，使內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)異常，而導(dǎo)致月經(jīng)異常

13、，同時(shí)抑制卵巢功能使絕經(jīng)期改變。　　林丹、開蓬等有機(jī)氯農(nóng)藥，可使雌性動(dòng)物陰道開啟和排卵周期延遲，甚至停止排卵，以及死胎和自然流產(chǎn)等。,（三）其它毒性作用,亦可表現(xiàn)在子代，造成畸形、死胎、功能發(fā)育不全等?！　「鞣N生殖功能毒性作用在整個(gè)生命過(guò)程的不同階段都可出現(xiàn)，這充分說(shuō)明雌性生殖毒性的復(fù)雜性。,三、雌性生殖毒性的檢測(cè)方法,（一）體外試驗(yàn)（書上表7-2）　　體外試驗(yàn)對(duì)于闡明化學(xué)毒物的毒性作用機(jī)理具有重要意義。但目前尚不能完全替代整體

14、動(dòng)物試驗(yàn)。（二）動(dòng)物試驗(yàn)　　整體動(dòng)物試驗(yàn)仍為主要評(píng)價(jià)方法，常用的方法有兩類：一類為一代繁殖試驗(yàn)或多代繁殖試驗(yàn)和致畸試驗(yàn)；另一類為三階段生殖試驗(yàn)。（三）其它輔助試驗(yàn)　　雌性動(dòng)物動(dòng)情周期觀察、排卵觀察、雌激素水平測(cè)定、病理組織學(xué)測(cè)定等。,第三節(jié) 致畸試驗(yàn),能引起妊娠的人或試驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生畸胎的外源化學(xué)物稱為致畸物。它通過(guò)胎盤直接作用于發(fā)育的胚胎和胎兒而產(chǎn)生后果。通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)和體外致畸試驗(yàn)方法，可檢測(cè)外源化學(xué)物能否引起胚胎毒

15、性或后代畸形。,一、動(dòng)物致畸試驗(yàn)（1）,（一）基本原理　　致畸試驗(yàn)是檢查受試外源化學(xué)物能否通過(guò)妊娠母體引起毒性或后代畸形的動(dòng)物試驗(yàn)。通過(guò)致畸試驗(yàn)可以確定一種受試物是否具有致畸作用。胚胎在器官形成期，可因受到化學(xué)物或放射性物質(zhì)的作用，使細(xì)胞分化、器官形成和正常發(fā)育收到阻滯，以致出現(xiàn)胎仔器官的器質(zhì)性缺陷而呈現(xiàn)畸形。因此，可以通過(guò)觀察妊娠母體在敏感期接觸受試物后胚胎及胎仔的發(fā)育狀況來(lái)評(píng)價(jià)某種外源化學(xué)物有無(wú)致畸作用。,一、動(dòng)物致

16、畸試驗(yàn)（2）,（二）基本方法?。?）動(dòng)物選擇－參照毒性試驗(yàn)中選擇動(dòng)物的一般原則及妊娠期較短而一致、產(chǎn)仔數(shù)多、胎盤結(jié)構(gòu)與人類接近、自發(fā)畸形率較低－－大鼠＋小鼠/家兔?。?）動(dòng)物交配處理?。?）劑量分組（關(guān)鍵）－要求出最大無(wú)作用劑量以及引起致畸的閾劑量、且要保持母體生育能力?。?）動(dòng)物剖檢－預(yù)期分娩前1～2d處死母體（防自食）　（5）胎仔檢查,（三）結(jié)果判定方法　　在致畸試驗(yàn)結(jié)果評(píng)定時(shí)，主要計(jì)算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)。在計(jì)算畸胎總數(shù)

17、時(shí)，每一活胎仔出現(xiàn)一種或一種以上畸形均作為一個(gè)畸胎。在計(jì)算畸形總數(shù)時(shí)，同一胎仔出現(xiàn)一種畸形作為一個(gè)畸形計(jì)算，出現(xiàn)兩種或兩個(gè)畸形，則作為兩個(gè)畸形計(jì)算，依此類推。,二、體外致畸作用試驗(yàn),體外致畸試驗(yàn)的方法很多，主要有體外全胚培養(yǎng)、器官培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)三個(gè)層次的試驗(yàn)。體外致畸試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是：1）可以節(jié)約大量人類和時(shí)間，方法快速；2）可利用人類的血清、尿液進(jìn)行試驗(yàn)，便于直接觀察受試物對(duì)接觸人群的作用；3）可利用單加氧酶或線粒體等酶觀察外源

18、化學(xué)物在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化過(guò)程對(duì)其致畸作用以及發(fā)育毒性的影響；4）容易嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，有可能排除母體中一些其它干擾因子和母體對(duì)致畸原的影響，有利于致畸作用劑量的探討。,第四節(jié) 繁殖試驗(yàn),繁殖試驗(yàn)的目的在于了解外源化學(xué)物對(duì)機(jī)體整個(gè)生殖過(guò)程以及對(duì)子代是否產(chǎn)生毒性作用。通過(guò)繁殖試驗(yàn)即可了解外源化學(xué)物對(duì)動(dòng)物性功能、交配行為、受精能力、分娩、授乳等過(guò)程的影響。,一、試驗(yàn)方法（1）,（一）試驗(yàn)動(dòng)物　　多選用健康剛斷乳大鼠。每組用20只雌鼠

19、，10只雄鼠。（二）染毒劑量及分組　　設(shè)對(duì)照組、高劑量組（為90d或長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的最大無(wú)作用劑量）、低劑量組（可以采用最大無(wú)作用劑量的1/30或人類可能攝入量的100倍）。必要時(shí)增設(shè)中間劑量組。接觸途徑與人類實(shí)際接觸的途徑相同。（三）試驗(yàn)步驟試驗(yàn)動(dòng)物按設(shè)計(jì)劑量先給予受試物90d，性成熟后即可按常規(guī)方式交配，所生仔鼠為第一代（F1）。每代交配兩次，第一次生仔（F1a）斷乳后10d再使親代進(jìn)行第二次交配，生仔為（F1b）。即第一代為

20、F1a和F1b。其余各代依此類推。,二、觀察指標(biāo),（1）交配指數(shù)（2）受精指數(shù)（3）受孕率（4）正常分娩率（5）活產(chǎn)率（6）妊娠率（7）出生存活率（8）哺乳存活率,三、結(jié)果判定,將試驗(yàn)組動(dòng)物各項(xiàng)觀察指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果與對(duì)照組動(dòng)物進(jìn)行比較，乳試驗(yàn)動(dòng)物在交配、妊娠、幼仔存活、幼仔發(fā)育（哺育）等方面收到影響，則說(shuō)明受試物對(duì)動(dòng)物繁殖功能有損害作用。,第五節(jié) 胚胎毒性－胎兒動(dòng)脈管畸形的研究方法（1）,胚胎毒性作用指外源化學(xué)物對(duì)母體子宮內(nèi)

21、發(fā)育的胚胎或胎兒產(chǎn)生的毒性作用。　　由外源化學(xué)物引起的胚胎毒性具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：　（1）胚胎死亡（危害最大）?。?）生長(zhǎng)發(fā)育遲緩　（3）胎兒先天缺陷和畸形（危害大，研究重點(diǎn)）?。?）功能發(fā)育不全,第五節(jié) 胚胎毒性－胎兒動(dòng)脈管畸形的研究方法（2）,胎兒動(dòng)脈管是直接把胎兒肺動(dòng)脈連接到大動(dòng)脈的輔助通路。是在母體內(nèi)見不到的獨(dú)特的血管。在胎生期內(nèi)動(dòng)脈管承擔(dān)著重要的循環(huán)作用?！　?dòng)脈管隨著妊娠末期的接近，徐徐增大其內(nèi)徑，胎兒

22、出生后，隨著肺呼吸的開始，動(dòng)脈管又引起收縮閉鎖，以索狀組織殘存在體內(nèi)?！　?dòng)脈管在胎生期內(nèi)，如果受到某種因素，如藥品、農(nóng)藥等影響引起收縮，則胎兒在出生為止可引起持續(xù)性地肺高血壓癥。胎兒出生后，由于某種原因引起胎兒動(dòng)脈管的收縮閉鎖，也可引起胎兒動(dòng)脈管的開放癥?！　∮滞庠椿瘜W(xué)物引起的胚胎毒性－胎兒動(dòng)脈管畸形（收縮）的研究方法，常用將大鼠胎兒固定于急速凍結(jié)臺(tái)后切割觀察法?！　∪绻庠椿瘜W(xué)物對(duì)胎生期的特殊血管－動(dòng)脈管產(chǎn)生毒性，則可觀察到胎