食品毒理學(xué)第七章化學(xué)毒物的生殖毒性

1、一、雄性生殖細胞的發(fā)生過程,精子的發(fā)生過程是指精原細胞發(fā)育成為成熟精子的過程。精子的發(fā)生過程始于胎兒期的原始生殖細胞。出生后，原始生殖細胞分化成精原細胞，后者直至青春期以前再曲細精管中處于休止?fàn)顟B(tài)。在青春期，在腦垂體促性腺激素的作用下，開始增殖，進行有絲分裂，形成兩個單倍體的次級精母細胞，再經(jīng)第二次成熟分裂，形成四個單倍體的精子細胞，精子細胞再經(jīng)過一系列形態(tài)學(xué)變化成為具有特殊形態(tài)的成熟精子。隨后由間質(zhì)細胞包裹釋放入輸精管內(nèi)，移入附睪后進

2、一步成熟，成為具有受精能力和活動力的精子，進入精囊并在此貯存?！　【影l(fā)生過程是在神經(jīng)內(nèi)分泌的精密調(diào)控下進行的。,第一節(jié) 雄性生殖毒性,一、雄性生殖細胞的發(fā)生過程,表7-1 外源化學(xué)物作用時間與精子發(fā)育階段,（一）對睪丸生精細胞的影響,1.棉酚 　　長期食用粗制棉子油－睪丸生精上皮丟失－睪丸內(nèi)精子、精細胞和精母細胞受損－精子細胞的頂體腫脹、分離與碎裂－精子中段的線粒體螺旋鞘排列紊亂、嵴目減少－通過葡萄糖和果糖代謝障礙抑制精子

3、活力－精子減少、不育2.工業(yè)污染物二硫化碳－睪丸損害、精子生產(chǎn)障礙3.鉛、鎘、汞、錳等重金屬－精子減少4.多種農(nóng)藥－精子減少、畸形、性功能減退,二、外源化學(xué)物的雄性生殖毒性,（二）對內(nèi)分泌功能的影響,睪丸的功能受垂體前葉分泌的促性腺激素的調(diào)節(jié)，而垂體分泌的促性腺激素又受下丘腦產(chǎn)生的促性腺釋放激素的調(diào)節(jié)。精子的生成是在神經(jīng)分泌的精密調(diào)節(jié)和控制下進行?！　≈亟饘巽U可干擾下丘腦－垂體－睪丸軸的正常功能，主要是影響促性腺釋放激

4、素（GnRH）的釋放，表現(xiàn)為卵泡刺激素（FSH）、黃體生成激素（LH）、睪酮含量降低。最終造成精子減少，活力減弱，性欲減退等。二硫化碳亦可導(dǎo)致睪酮減少、精子生成障礙等。,（三）對性功能和生殖功能的影響,外源化學(xué)物（化學(xué)毒物）如果造成生殖系統(tǒng)任何一個環(huán)節(jié)的異常，則表現(xiàn)出雄性不育，即雄性性功能障礙。如鉛、鎘、汞、錳等重金屬。,（一）精子生成分析,（1）精子計數(shù)－數(shù)目減少量－確定有無毒害作用發(fā)生（2）精子形態(tài)觀察－頭尾部的形態(tài)改變

5、（3）精子狀態(tài)分析試驗－靜夜的pH、液化時間，精子運動能力，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和微量元素的含量等－是否與外源化學(xué)物有關(guān),三、雄性生殖毒性的檢測方法,（二）精子穿透試驗,即精子體外受精實驗，是檢測精子在體外能否成功穿透去透明帶的金黃地鼠卵子而受精的試驗，為綜合評價外源化學(xué)物對人類精子受精能力的影響、探明雄性不育提供科學(xué)依據(jù)。,（三）睪丸中標(biāo)志酶活性的測定,臨床和動物試驗中常檢測乳酸脫氫酶同工酶x、山梨醇脫氫酶、6－磷酸葡萄糖脫氫酶的

6、變化，并結(jié)合精子生成過程中各階段細胞的功能和形態(tài)學(xué)改變，即可評價外源化學(xué)物的生殖毒性，并有可能探明毒性作用部位和機理。,（四）體外試驗,體外試驗主要是將哺乳動物的生殖細胞在體外條件下進行培養(yǎng)，并與受試外源化學(xué)物接觸，觀察生殖細胞的變化?！　⊥ㄟ^支持細胞和間質(zhì)細胞等體外分離培養(yǎng)，測定支持細胞的乳酸含量和乳酸脫氫酶活性的變化以及測定間質(zhì)細胞分泌的雄激素含量來判斷外源化學(xué)物是否對所培養(yǎng)細胞的功能有影響?！　∫嗫煞蛛x上述細胞，通過細胞計數(shù)和

7、形態(tài)學(xué)檢查的方法來判斷。,（五）雄性激素檢測,雄性生殖系統(tǒng)無論生精過程、精子成熟過程，還是附屬性腺的分泌活動，都需要有足夠的睪酮，通過檢測FSH、LH和睪酮的含量變化來判斷外源化學(xué)物是否對雄性生殖產(chǎn)生影響。檢測上述三種性激素含量有助于生殖毒性的評價以及生殖毒作用機制的探討。,（六）顯性致死試驗,顯性致死試驗是通過給予雄性動物受試化學(xué)物，將其與未經(jīng)受試物處理的雌性動物交配，觀察雌性動物早期胚胎死亡情況，以評價受試物是否對雄性動物的生殖有損

8、害作用的試驗?！　”痉椒ㄏ挡捎貌溉閯游镞M行試驗，較接近人體實際情況，主要觀察指標(biāo)為胚胎早期死亡，即觀察子宮中活胎、死胎及吸收胎等書目，易于觀察，實驗技術(shù)容易掌握，不需要復(fù)雜的試驗條件。缺點是不夠靈敏。,（七）雄性生殖細胞遺傳毒性檢測,傳統(tǒng)檢測方法：小鼠睪丸染色體畸變分析試驗、小鼠精子畸變分析試驗、黑腹果蠅染色體性陰性分析試驗　　新方法：單細胞凝膠電泳試驗（彗星試驗）　　原理：細胞在體內(nèi)和體外試驗中受化學(xué)物作用后，DNA鏈發(fā)生斷裂。

9、將細胞制成單細胞混懸液，在載玻片上制備加有受檢細胞混懸液的凝膠，載堿性條件下使細胞裂解，解旋DNA后進行電泳。帶負電荷的DNA斷裂端由陰極向陽極遷移。DNA經(jīng)EB染色后在熒光顯微鏡下可觀察到DNA受損的細胞核拖一條尾巴，呈彗星狀，如DNA無損傷則見圓形的核。,（八）雄性生殖毒性病理檢查,睪丸、附睪、前列腺已經(jīng)精囊的重量和大小的改變常是接觸有害化學(xué)物的明顯特征。睪丸組織易受外來化學(xué)毒物的侵害，因此在亞慢性或慢性動物毒性試驗中，睪丸組織形

10、態(tài)檢查是一項重要的觀察指標(biāo)?！　〗馄视^察是生殖病理檢驗的主要環(huán)節(jié)，是雄性生殖毒理學(xué)研究中不可缺少的較為敏感的指標(biāo)和重要手段。,一、雌性生殖細胞的發(fā)生過程,雌性生殖系統(tǒng)由卵巢、輸卵管、子宮和外生殖器等組成?！　÷雅荩ò鸭毎念w粒細胞和膜細胞）的發(fā)育是一個連續(xù)變化的過程，一般可分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡四個階段?！　÷殉驳闹芷谛宰兓齽忧橹芷诿芮邢嚓P(guān)?！　〕跫壜涯讣毎M一步成熟并發(fā)育至次級卵母細胞，

11、需垂體下葉分泌的FSH和LH的作用。,第二節(jié) 雌性生殖毒性,（一）對卵細胞的影響,研究表明，卵細胞發(fā)育到排卵前階段即第一次減數(shù)分裂的終變期和中期對化學(xué)毒物最敏感?！　∪珂k，NIH雌性小鼠皮下一次注射氯化鎘1、3、6mg/kg后，排卵能力明顯受抑制，排卵數(shù)目隨劑量增加而減少，呈明顯的劑量－反應(yīng)關(guān)系。鎘可能直接進入到卵細胞內(nèi)并損傷其遺傳物質(zhì)。鎘－－金屬硫蛋白中Zn2+　　二硫化碳不僅對多種動物的睪丸有毒性作用，而且對雌性動物

12、性腺、胚胎也有損害作用，可影響卵巢，使動物的動情周期發(fā)生改變，受孕能力降低，影響受精卵和胚胎的正常發(fā)育?！?二、外源化學(xué)物的雌性生殖毒性,（二）對內(nèi)分泌功能的影響,卵巢的功能和生殖周期受體內(nèi)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，即通過下丘腦－垂體－性腺軸。外源化學(xué)物可影響上述任何一個環(huán)節(jié)而對雌性生殖產(chǎn)生損害作用?！　”郊捌渫滴镌谝欢▌┝肯聲斐纱菩缘纳彻δ軗p害，該類化學(xué)物直接干擾下丘腦，作用于垂體－卵巢系統(tǒng)，使內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)異常，而導(dǎo)致月經(jīng)異常

13、，同時抑制卵巢功能使絕經(jīng)期改變?！　×值?、開蓬等有機氯農(nóng)藥，可使雌性動物陰道開啟和排卵周期延遲，甚至停止排卵，以及死胎和自然流產(chǎn)等。,（三）其它毒性作用,亦可表現(xiàn)在子代，造成畸形、死胎、功能發(fā)育不全等?！　「鞣N生殖功能毒性作用在整個生命過程的不同階段都可出現(xiàn)，這充分說明雌性生殖毒性的復(fù)雜性。,三、雌性生殖毒性的檢測方法,（一）體外試驗（書上表7-2）　　體外試驗對于闡明化學(xué)毒物的毒性作用機理具有重要意義。但目前尚不能完全替代整體

14、動物試驗。（二）動物試驗　　整體動物試驗仍為主要評價方法，常用的方法有兩類：一類為一代繁殖試驗或多代繁殖試驗和致畸試驗；另一類為三階段生殖試驗。（三）其它輔助試驗　　雌性動物動情周期觀察、排卵觀察、雌激素水平測定、病理組織學(xué)測定等。,第三節(jié) 致畸試驗,能引起妊娠的人或試驗動物產(chǎn)生畸胎的外源化學(xué)物稱為致畸物。它通過胎盤直接作用于發(fā)育的胚胎和胎兒而產(chǎn)生后果。通過動物試驗和體外致畸試驗方法，可檢測外源化學(xué)物能否引起胚胎毒

15、性或后代畸形。,一、動物致畸試驗（1）,（一）基本原理　　致畸試驗是檢查受試外源化學(xué)物能否通過妊娠母體引起毒性或后代畸形的動物試驗。通過致畸試驗可以確定一種受試物是否具有致畸作用。胚胎在器官形成期，可因受到化學(xué)物或放射性物質(zhì)的作用，使細胞分化、器官形成和正常發(fā)育收到阻滯，以致出現(xiàn)胎仔器官的器質(zhì)性缺陷而呈現(xiàn)畸形。因此，可以通過觀察妊娠母體在敏感期接觸受試物后胚胎及胎仔的發(fā)育狀況來評價某種外源化學(xué)物有無致畸作用。,一、動物致

16、畸試驗（2）,（二）基本方法?。?）動物選擇－參照毒性試驗中選擇動物的一般原則及妊娠期較短而一致、產(chǎn)仔數(shù)多、胎盤結(jié)構(gòu)與人類接近、自發(fā)畸形率較低－－大鼠＋小鼠/家兔　（2）動物交配處理?。?）劑量分組（關(guān)鍵）－要求出最大無作用劑量以及引起致畸的閾劑量、且要保持母體生育能力?。?）動物剖檢－預(yù)期分娩前1～2d處死母體（防自食）?。?）胎仔檢查,（三）結(jié)果判定方法　　在致畸試驗結(jié)果評定時，主要計算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)。在計算畸胎總數(shù)

17、時，每一活胎仔出現(xiàn)一種或一種以上畸形均作為一個畸胎。在計算畸形總數(shù)時，同一胎仔出現(xiàn)一種畸形作為一個畸形計算，出現(xiàn)兩種或兩個畸形，則作為兩個畸形計算，依此類推。,二、體外致畸作用試驗,體外致畸試驗的方法很多，主要有體外全胚培養(yǎng)、器官培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)三個層次的試驗。體外致畸試驗的優(yōu)點是：1）可以節(jié)約大量人類和時間，方法快速；2）可利用人類的血清、尿液進行試驗，便于直接觀察受試物對接觸人群的作用；3）可利用單加氧酶或線粒體等酶觀察外源

18、化學(xué)物在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化過程對其致畸作用以及發(fā)育毒性的影響；4）容易嚴格控制試驗條件，有可能排除母體中一些其它干擾因子和母體對致畸原的影響，有利于致畸作用劑量的探討。,第四節(jié) 繁殖試驗,繁殖試驗的目的在于了解外源化學(xué)物對機體整個生殖過程以及對子代是否產(chǎn)生毒性作用。通過繁殖試驗即可了解外源化學(xué)物對動物性功能、交配行為、受精能力、分娩、授乳等過程的影響。,一、試驗方法（1）,（一）試驗動物　　多選用健康剛斷乳大鼠。每組用20只雌鼠

19、，10只雄鼠。（二）染毒劑量及分組　　設(shè)對照組、高劑量組（為90d或長期毒性試驗的最大無作用劑量）、低劑量組（可以采用最大無作用劑量的1/30或人類可能攝入量的100倍）。必要時增設(shè)中間劑量組。接觸途徑與人類實際接觸的途徑相同。（三）試驗步驟試驗動物按設(shè)計劑量先給予受試物90d，性成熟后即可按常規(guī)方式交配，所生仔鼠為第一代（F1）。每代交配兩次，第一次生仔（F1a）斷乳后10d再使親代進行第二次交配，生仔為（F1b）。即第一代為

20、F1a和F1b。其余各代依此類推。,二、觀察指標(biāo),（1）交配指數(shù)（2）受精指數(shù)（3）受孕率（4）正常分娩率（5）活產(chǎn)率（6）妊娠率（7）出生存活率（8）哺乳存活率,三、結(jié)果判定,將試驗組動物各項觀察指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果與對照組動物進行比較，乳試驗動物在交配、妊娠、幼仔存活、幼仔發(fā)育（哺育）等方面收到影響，則說明受試物對動物繁殖功能有損害作用。,第五節(jié) 胚胎毒性－胎兒動脈管畸形的研究方法（1）,胚胎毒性作用指外源化學(xué)物對母體子宮內(nèi)

21、發(fā)育的胚胎或胎兒產(chǎn)生的毒性作用?！　∮赏庠椿瘜W(xué)物引起的胚胎毒性具體表現(xiàn)在以下幾個方面：　（1）胚胎死亡（危害最大）?。?）生長發(fā)育遲緩?。?）胎兒先天缺陷和畸形（危害大，研究重點）　（4）功能發(fā)育不全,第五節(jié) 胚胎毒性－胎兒動脈管畸形的研究方法（2）,胎兒動脈管是直接把胎兒肺動脈連接到大動脈的輔助通路。是在母體內(nèi)見不到的獨特的血管。在胎生期內(nèi)動脈管承擔(dān)著重要的循環(huán)作用。　　動脈管隨著妊娠末期的接近，徐徐增大其內(nèi)徑，胎兒

22、出生后，隨著肺呼吸的開始，動脈管又引起收縮閉鎖，以索狀組織殘存在體內(nèi)。　　動脈管在胎生期內(nèi)，如果受到某種因素，如藥品、農(nóng)藥等影響引起收縮，則胎兒在出生為止可引起持續(xù)性地肺高血壓癥。胎兒出生后，由于某種原因引起胎兒動脈管的收縮閉鎖，也可引起胎兒動脈管的開放癥?！　∮滞庠椿瘜W(xué)物引起的胚胎毒性－胎兒動脈管畸形（收縮）的研究方法，常用將大鼠胎兒固定于急速凍結(jié)臺后切割觀察法?！　∪绻庠椿瘜W(xué)物對胎生期的特殊血管－動脈管產(chǎn)生毒性，則可觀察到胎