堿性磷酸酶-孔雀綠定磷法篩選磷酸二酯酶4抑制劑.pdf

1、在大腸桿菌中表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白融合的人環(huán)核苷酸磷酸二酯酶482（MBP-hPDE482）。pMAL-p2x-PDE482質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21在18℃誘導(dǎo)16h后，產(chǎn)生可溶性MBP-hPDE482。MBP-hPDE482經(jīng)直鏈淀粉樹(shù)脂一步純化后純度達(dá)到35％。用本論文所建立的偶聯(lián)堿性磷酸酶的孔雀綠定磷法測(cè)得此PDE4的Km為9.2±0.4μM（n=5），其對(duì)rolipram和鋅離子很敏感，比活性可達(dá)0.1U·mg-1，有望用于PDE4

2、抑制劑篩選。 用孔雀綠定量小牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）作用于環(huán)核苷酸磷酸二酯酶4（PDE4）產(chǎn)物AMP釋放的無(wú)機(jī)磷酸，建立測(cè)定PDE活性的光度法并嘗試用于篩選PDE4抑制劑。在孔雀綠定磷反應(yīng)體系先加入鉬酸銨，再加入孔雀綠顯色。定磷體系終濃度2％的甘油可穩(wěn)定孔雀綠和磷鉬雜多酸復(fù)合物，其在630nm的吸收與磷酸濃度成比例，并可以耐受PDE4反應(yīng)體系除了罌粟堿外常見(jiàn)物質(zhì)的干擾。在PH7.4和0.20mM EDTA存在下，堿性磷酸酶

3、對(duì)AMP的米氏常數(shù)（Km）為12.0±2.1μM（n=3）。在偶聯(lián)CIAP的終點(diǎn)法中，用終濃度為5％的高氯酸終止PDE4和CIAP作用后用孔雀綠結(jié)合法測(cè)定無(wú)機(jī)磷生成量。PDE4反應(yīng)體系含10.0mM MgCl2和0.10mM EDTA，以及30.0U.L-1CIAP。此條件下，反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)延遲時(shí)間一般在1.0min以內(nèi)；30min內(nèi)釋放無(wú)機(jī)磷酸的速度對(duì)PDE4量在很寬范圍內(nèi)成線性響應(yīng)。因此，此堿性磷酸酶偶聯(lián)的孔雀綠定磷法有望用于篩選對(duì)孔

4、雀綠定磷法無(wú)干擾的PDE抑制劑。 用此法成功測(cè)定了MBP-hPDE4的Km，rolipram對(duì)此hPDE4的抑制常數(shù)為11nM。在酶標(biāo)板中用定磷法要求所用酶蛋白盡量少，以便用高氯酸終止反應(yīng)后不需離心去蛋白就能定量無(wú)機(jī)磷酸。用聯(lián)苯胺對(duì)高比活性CIAP抑制為模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只要所用靶酶量足夠少使反應(yīng)體系的蛋白濃度足夠低，此孔雀綠定磷法可不離心去蛋白就能測(cè)定磷酯水解酶活性，從而可建立磷酯水解酶抑制劑的高通量篩選系統(tǒng)。因此，獲得高比活性