高效快速的點(diǎn)突變方法

1、高效快速的點(diǎn)突變方法,,,陳 嚴(yán) 姜 明 湯 敏謙,寶生物工程（大連）有限公司,116600,目的： 1.在目的基因中的特定位點(diǎn)導(dǎo)入突變，包括：,,,● 堿基缺失 ● 堿基置換 ● 堿基插入,2. 通過(guò)突變基因的表達(dá)，可以為蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)及功能的分析和改造提供有效途徑。,,,TaKaRa用于定點(diǎn)突變的試劑盒,■ Mutan-Express Km Kit ■ Mutan-Super Express

2、Km Kit■ Mutan-K Kit■ TaKaRa MutanBEST Kit,,,Mutan-Express Km,,,原理：ODA法,,,E.coli BMH71-18 mutS、MV1184 Competent Cell or Electro Cell導(dǎo)入變異Primer,材料與方法,Materials,,,,Protocol,Reaction Mixture,Annealing/Extension,DNA Sample

3、,Transformation（1）E.coli BMH71-18 mutS,Plasmid Miniprep,DNA,Transformation（2）MV1184,Colony,Sequencing,,,,,,,,,,,Mutan-Super Express Km,,,原 理：ODA-LA PCR法,,,E.coli MV1184 Competent Cell or Electro CellpKF18k/pKF19k DNA

4、導(dǎo)入變異用寡聚核苷酸（5′-P）,材料與方法,Materials,,,,Reaction Mixture,PCR反應(yīng),DNA精制,Transformation sup0 菌株（MV1184）,Sequencing,Colony,Protocol,,,,,,,,,Mutan-K,,,原理：Kunkel法,,,材料與方法,E.coli BMH71-18 mutS 、 CJ236 、MV1184 Competent Cell or Elect

5、ro Cell導(dǎo)入變異用寡聚核苷酸M13 mp18 RF or M13 mp19 RF or pUC118/119,Materials,,,,Protocol,Cloned DNA（M13）,Transfection CJ236,ssDNA Sample,變異用寡聚核苷酸,5′磷酸化,Annealing,Extension,DNA Sample,Transfection BMH71-18 mutS,Phage,Transfect

6、ion MV1184（ung+ Cell）,噬菌斑,,,,,,,,,,,,,,,,,TaKaRa MutanBEST,,,原理：PCR法,,,材料與方法,導(dǎo)入變異用PrimerE.coli JM109 Competent cell,Materials,,,,Protocol,Reaction Mixture,PCR反應(yīng),電泳回收PCR Fragment,BKL反應(yīng),DNA Sample,Transformation（JM109）,Se

7、quencing,Colony,,,,,,,,,,,TaKaRa MutanBEST Kit使用實(shí)例,5′ GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTG 3′3′ CTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGAC 5′,pUC118,引入點(diǎn)變異區(qū)域堿基序列,GGATCCTCTAGAGTCGACCTG,

8、CTTAAGCTCGAGCCATGGGCC,,,Primer 1,,,Primer 2,,,,Step I . PCR反應(yīng),10×Pyrobest BufferdNTP Mixtrue（各2.5 mM）Primer 1Primer 2TemplatePyrobest DNA Polymerase (5 U/ml)滅菌蒸餾水 up to,5 μl 　

9、 4 μl0.2～1.0 μM(final conc.)0.2～1.0 μM(final conc.) <1 μg 0.25 μl 50 μl,94℃ 30 sec 55℃ 30 sec 72℃ 5min,,30 Cycles,,,,PCR Fragment10×Blunting Kination BufferBlunting Kination

10、 Enzyme Mix.ddH2O up to,2 μl 1 μl20 μl,0.2-20 pmol,Step Ⅱ . Blunting Kination Reaction,,37℃，10min.,,,,,Step Ⅲ. Ligation Reaction,DNA Fragment 5μl L

11、igation Solution I 5μl,16℃,1hr Transformation JM109 Colony,,,Sequencing,,,,,結(jié)果：,1. Transformation,2. Sequencing挑取10個(gè)藍(lán)色菌落進(jìn)行測(cè)序，證明完全回復(fù)pUC118正常堿基序列，且在其它位置未發(fā)現(xiàn)有變異出現(xiàn)。,,,TaKaR