中國人群非綜合征性耳聾高頻突變位點的快速熒光篩查.pdf

1、目的：先天性非綜合征性耳聾與人自身染色體上某些特定位點的變異相關(guān)。目前的檢測手段不是比較昂貴就是操作繁瑣容易出錯，而且能夠同時檢測的突變位點非常有限。本課題研究的目的在于開發(fā)一種可以同時檢測大部分相關(guān)突變位點的具有快速、價廉、操作方便等特點的實時熒光PCR檢測方法。運用本項技術(shù)開發(fā)的先天非綜合征性耳聾相關(guān)突變位點檢測方法不僅可以檢測病人的突變位點，更重要的是可以在婚前，產(chǎn)前預(yù)防性篩查相關(guān)突變位點攜帶者，對提高人口素質(zhì)，提高家庭生活質(zhì)量有

2、著重大意義。
　　方法：查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻，找出與中國人群先天性非綜合征性耳聾相關(guān)的突變位點，根據(jù)NCBI Gene數(shù)據(jù)庫中所列出的基因序列設(shè)計引物從CDNA文庫克隆含目的突變位點的DNA片段，回收目的片段并連接入目標載體。設(shè)計突變引物，利用定點突變方法得到含有突變位點的重組質(zhì)粒。利用建立起來的防污染仿基因組PCR反應(yīng)體系以重組質(zhì)粒為模板篩選針對突變型等位基因的等位基因特異性引物。設(shè)計針對每個突變位點的分子信標和內(nèi)參信標，利用之前

3、得到的等位基因特異性引物，優(yōu)化篩選出檢測突變型基因的多重實時熒光PCR反應(yīng)條件。收集目標人群DNA樣本，驗證整個篩查體系的可行性和準確性。
　　結(jié)果：經(jīng)文獻查找發(fā)現(xiàn)與中國人群先天性非綜合征性耳聾相關(guān)的熱點突變位點共有32個，實驗克隆出了含目的突變位點的DNA片段，并且利用定點突變技術(shù)突變相應(yīng)的基因序列，構(gòu)建出含有目的基因片段的野生型重組質(zhì)粒和突變型重組質(zhì)粒；利用含鮭魚精DNA的仿基因組體系和含有dUTP，尿嘧啶糖苷酶（UNG酶）的