天然化合物抗腫瘤藥物開發(fā)研究-開題報告

1、一 立論依據(jù)本課題的研究背景及意義,目前，天然化合物的開發(fā)研究越來越受到重視，其在化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性、復(fù)雜性、以及在生物活性方面的顯著優(yōu)勢而成為發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新新藥的捷徑,,廣西天然藥物資源豐富，雖然中成藥產(chǎn)品品種較多，但本地區(qū)地道傳統(tǒng)中藥品種在中藥有效性、活性定位等方面研究還缺乏系統(tǒng)性，嚴重影響相關(guān)新藥開發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量的控制。,,目前用于臨床的抗腫瘤藥存在選擇性差，免疫抑制及不良反應(yīng)多而嚴重等缺點 中藥抗腫瘤以其多靶點、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的

2、特點，同時其毒副作用低，能提高機體免疫力，不易產(chǎn)生耐藥性，而成為近年來研究的熱點,,本課題的研究將本地區(qū)地道傳統(tǒng)中藥品種的抗腫瘤有效成分、作用機理、毒理及代謝過程作為研究重點，為新藥開發(fā)過程中的質(zhì)量控制提供理論支持，加速中藥現(xiàn)代化進程，力爭高效率的開發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的中藥新藥和創(chuàng)新化學(xué)藥品,本課題選用藥物來源,白花丹（Plumbago Zeylanica L）屬藍雪科藍雪屬，別名白雪花，為亞灌木狀草本。味辛苦，性溫，微毒，全株供藥用

3、。我國南部和西南部均有分布，資源豐富。廣西民間用于散瘡、消腫、痛經(jīng)活絡(luò)、并治蛇傷、風(fēng)濕、乳腺炎以及慢性氣管炎等癥 。文獻報道有抗腫瘤作用。兩面針，又名入地金牛、入山虎、兩背針，來源于蕓香科植物兩面針（Zanthoxylum nitidum (Roxb.)DC.）的干燥根，中國藥典從1995年版開始收載，為我國南方常用中藥。能行氣止痛、活血化瘀、通絡(luò)祛風(fēng)。主治跌打、風(fēng)濕痹痛、牙痛、胃痛、毒蛇咬傷，外用治湯火燙傷等。其化學(xué)成分主要有苯駢菲

4、啶類生物堿、黃酮類、木脂素類等。兩面針提取物的主要藥理作用有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、解痙及心血管系統(tǒng)等方面,藥物的合成,對已篩選、分離鑒定出的白花丹、兩面針的抗腫瘤有效成分（單體），從整體思想出發(fā)，運用配位化學(xué)的原理和組合化學(xué)的方法使之與一些其金屬配合物已被用于治療腫瘤的臨床應(yīng)用或臨床試驗的金屬離子或多金屬氧鹽，合成系列金屬配合物，以增加作用靶點 。,國內(nèi)外研究現(xiàn)狀,國內(nèi)對白花丹研究不夠系統(tǒng)，對其有效成分作用機理只是停留在簡單藥理作用研究

5、國外鮮見此方面研究報道。國內(nèi)對兩面針研究主要集中在兩面針堿提取物的簡單利用，如消炎藥、兩面針牙膏、鎮(zhèn)痛藥等。國外對兩面針的研究已處于領(lǐng)先階段，如日本有些研究已達到臨床試驗階段,二、研究目標(biāo),篩選出抗腫瘤活性較好的天然化合物和配合物，并初步給出這些天然化合物和配合物的藥效學(xué)和毒理學(xué)評價，為進一步研究臨床應(yīng)用的可能性提供依據(jù),三、研究內(nèi)容,將合成的幾十種天然化合物和配合物通過對人類腫瘤細胞的生長抑制實驗（MTT法、SRB法等）快速篩選出有

6、效的配合物，求出IC50確定進一步實驗的配合物 進行體外毒理學(xué)實驗，通過原代培養(yǎng)的大鼠肝細胞及骨髓細胞初步了解篩選有效的天然化合物和配合物對正常肝細胞和骨髓細胞的毒性作用,,在合作單位提供合理的藥物劑型的基礎(chǔ)上，進行急性毒性實驗、得出動物半數(shù)致死量（LD50）觀察藥物的中毒表現(xiàn) 采用小鼠荷瘤動物模型，觀察被試藥物對腫瘤的抑制作用，摸索出有效的少毒劑量，通過計算得的腫瘤抑制率，評價被試藥物的抗腫瘤效果,四、擬采用的研究方法、關(guān)鍵技術(shù)指

7、標(biāo)及解決途徑,㈠ 針對白花丹、兩面針分離出的天然化合物和用組合化學(xué)的方法合成的金屬配合物，進行對人類腫瘤細胞的生長抑制實驗 腫瘤細胞的培養(yǎng)：從國內(nèi)或國外進口的人類腫瘤細胞株（KB、SGC7901、Hela、A549 等）采用DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，添加10%－20%胎?；蛐律Ｑ?，在37℃，5％CO2，環(huán)境培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 體外藥物敏感實驗：取對數(shù)生長期的各種腫瘤細胞，以某濃度通過MTT法快速得出各種被試藥物相對于各個腫瘤

8、細胞的在該濃度下的細胞生長抑制率，以此為基礎(chǔ)設(shè)立濃度梯度分別應(yīng)用SRB法、MTT法、集落形成實驗法求出有效藥物的IC50以確定進一步實驗的化合物。,㈡對初步篩選出來的各種藥物同時進行體內(nèi)和體外的毒理學(xué)實驗,使用兩步灌流法分離培養(yǎng)原代正常大鼠肝細胞。通過測定培養(yǎng)皿乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量來反映細胞膜的完整性，即細胞活性，以大鼠白蛋白和尿素的生成量來反映細胞的肝功能水平，考察被試藥物對體外培養(yǎng)大鼠肝細胞的毒性。LDH以比色法測定，尿素氮

9、以二乙酰－肟法測定，大鼠白蛋白以酶聯(lián)免疫(ELISA)法測定。 取正常大鼠骨髓細胞體外培養(yǎng)，給藥后作染色觀察各系細胞的集落情況，通過電鏡觀察細胞的調(diào)亡或壞死情況 通過急性毒理學(xué)實驗觀察動物有那些中毒表現(xiàn)，毒性反應(yīng)出現(xiàn)的速度，中毒死亡過程的特征，推測死亡原因和可能的毒性靶器官。同時觀察被試藥物毒性反應(yīng)與劑量的關(guān)系得出半數(shù)致死劑量（LD50 ）,㈢用動物模型試驗篩選出的有效藥物，觀察藥物的抑瘤效果,采用小鼠S180肉瘤及小

10、鼠慢性粒細胞白血病兩種動物模型，參照有關(guān)文獻給藥方法，觀察受試品對腫瘤的抑制作用，對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理、評價受試品的抗腫瘤效果,五、完成本項課題已經(jīng)具備的條件,實驗室條件：廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)學(xué)科是廣西重點學(xué)科，是藥理學(xué)博士學(xué)位授予單位，科研力量雄厚，各種儀器設(shè)備齊全。同時本校醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心、臨床醫(yī)學(xué)實驗中心都可提供大量儀器設(shè)備及動物實驗所需儀器。實驗所需試劑國內(nèi)外均可方便購買。腫瘤細胞可從上海購買。 前期工作：本人導(dǎo)師長期從

11、事中藥的新制劑、新劑型研究，在新藥研發(fā)工作中積累了豐富的經(jīng)驗。合作單位廣西師范大學(xué)化學(xué)系負責(zé)提取工作，該?；瘜W(xué)系師資力量雄厚，多年從事天然植物藥用作用物質(zhì)的提取研究，有幾十篇SCI影響因子大于2的文章發(fā)表。 資金情況：本課題屬于《廣西特有藥用植物作用物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機理研究》（2004年國家自然科學(xué)基金，60萬元）,六、課題的創(chuàng)新點,研究思想創(chuàng)新：本課題應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)進行中藥現(xiàn)代化研究，從已明確的有抗腫瘤作用的植物提取天然化合物單

12、體以及其配合物，重點評價其藥效及肝、骨髓毒性以配合同時進行的課題組其它成員進行的分子機制研究，查閱文獻，有關(guān)此類的文獻較少。 研究體系創(chuàng)新：體外毒理學(xué)是目前毒理學(xué)發(fā)展的新趨勢，本課題選用肝及骨髓的原代培養(yǎng)細胞做體外培養(yǎng)進行毒理學(xué)評價，預(yù)測被試藥物的毒性和可開發(fā)價值。 應(yīng)用前景：通過本課題的研究，將為天然藥物和無機抗腫瘤新藥的研究與開發(fā)提供理論和實驗基礎(chǔ)，并提供新思路，將為廣西地道藥用植物的深度開發(fā)提供理論和技術(shù)支持，加速廣西