工業(yè)發(fā)酵染菌的防治

1、第七章 工業(yè)發(fā)酵染菌的防治,本章內(nèi)容簡介,染菌的危害染菌的發(fā)現(xiàn)染菌的分析染菌的預防染菌后的挽救,1 染菌的危害,浪費原材料，造成巨大經(jīng)濟損失 擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計劃 影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性 影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量,1.1 染菌對發(fā)酵的影響,生產(chǎn)菌種污染微生物的種類和性質(zhì)、污染菌量污染時間，污染途徑培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件,感染不同種類和性質(zhì)雜菌對發(fā)酵的影響不同,染菌對不同產(chǎn)品的影響不同,不同染菌時間對發(fā)酵

2、的影響不同,,染菌危害,一、染菌對不同產(chǎn)品的影響青霉素：產(chǎn)量降低；疫苗：全部廢棄。檸檬酸：前期染菌嚴重；氨基酸：噬菌體污染常發(fā)生；核苷酸：易染菌（生產(chǎn)菌常為缺陷型，生長慢）；鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素：程度不同地降低產(chǎn)量。灰黃霉素、制霉菌素、克念菌素：抑制霉菌，對細菌幾乎沒有抑制和殺滅作用。,二、不同種類和性質(zhì)的雜菌對發(fā)酵的影響污染噬菌體 噬菌體的感染力強，傳播蔓延迅速，也較防治，故危害極大。

3、 污染噬菌體后，可使發(fā)酵產(chǎn)量大幅度下降，嚴重的造成斷種，被迫停產(chǎn)。,污染其它雜菌 有些雜菌會使生產(chǎn)菌自溶產(chǎn)生大量泡沫，即使添加消泡劑也無法控制逃液，影響發(fā)酵過程的通氣攪拌。 有的雜菌會使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，致使pH下降，使不耐酸的產(chǎn)品破壞。 芽孢桿菌耐熱，不易殺死。,不同發(fā)酵對雜菌感染的敏感性不同。(1)青霉素和鏈霉素：細短桿菌的危害大于粗大桿菌；(2)四環(huán)素：對雙球菌、芽孢桿菌和莢膜桿菌污染敏

4、感；(3)檸檬酸：對青霉菌敏感；(4)核苷酸：對芽孢桿菌敏感(5)氨基酸：對噬菌體敏感；,三、不同染菌時間對發(fā)酵的影響 污染時間：無菌檢測方法測出的污染時間，不是雜菌竄入培養(yǎng)液的時間。 (1)種子染菌：影響最大；(2)前期：滅菌后重新接種；(3)中期：對生產(chǎn)影響大；(4)后期：一般不嚴重，若嚴重時可放罐；,,1.4 發(fā)酵染菌對提煉和產(chǎn)品質(zhì)量的影響,1）發(fā)酵染菌對過濾的影響,粘度大 ? 過濾困難 ?拉長過

5、濾時間，影響設備周轉(zhuǎn) 降低過濾收率影響程度：雜菌種類，污染程度措施：加熱、冷卻、添加助濾劑等,2） 發(fā)酵染菌對提煉的影響,沉淀法：雜質(zhì)污染產(chǎn)物 有機溶劑萃取：乳化，難分離。 離子交換：降低離子交換樹脂的交換容量，雜菌難沖洗干凈，洗脫時與產(chǎn)物一起進入洗脫液。,2 染菌的表現(xiàn),種子：生長緩慢菌絲結(jié)團代謝異常,發(fā)酵：菌體生長差pH異常溶氧異常泡沫過多菌體濃度異常,3 染菌的分析,總?cè)揪手敢荒臧l(fā)酵染菌的批（次）數(shù)

6、與總投料批（次）數(shù)之比的百分率。包括染菌后培養(yǎng)基經(jīng)重新滅菌，又再次染菌的批次數(shù)在內(nèi)?？?cè)揪?=,,染菌原因：種子、無菌空氣、設備滲漏、滅菌不徹底、操作不當、管理不善等。染菌時間早期：種、氣、設備、滅菌不徹底、操作不當；后期：補料不當、滲漏。,染菌種類耐熱芽孢桿菌：滅菌不徹底；球菌或無芽孢桿菌：種、滲漏；淺綠色雜菌：冷水管滲漏；霉菌：滅菌不徹底或操作問題；染菌幅度各個或數(shù)個發(fā)酵罐感染相同雜菌：空氣系統(tǒng)；個別罐連續(xù)

7、感染雜菌：設備問題；,日本工業(yè)技術院發(fā)酵研究所多年來抗生素發(fā)酵染菌原因分析 項目 百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌 9.64接種時罐壓跌零 0.19培養(yǎng)基滅菌不透 0.79總空氣系統(tǒng)有菌

8、 19.96泡沫冒頂 0.48夾套穿孔 12.36盤管穿孔 5.89接種管穿孔

9、 0.39閥門滲漏 1.45攪拌軸密封滲漏 2.09罐蓋漏 1.54其它設備滲漏 10.13操

10、作原因 10.15 原因不明 24.94,上海第三制藥廠染菌原因分析 項目 百分率%種子帶菌 14.15盤管穿孔

11、 14.20閥門滲漏 23.30空氣系統(tǒng)有菌 10.0管理不善 25.80其它 7.49原因不明 5.78,管理不善而染菌的有31個罐批，占25.08％經(jīng)

12、分析有下表所列原因： 項目 百分率%進罐前未做設備嚴密度檢查 25.8接種違反操作規(guī)程 25.8檢修質(zhì)量缺乏驗收制度 19.35操作不熟練 19.35配料違反

13、工藝規(guī)程 6.45調(diào)度不當 3.25,第四制藥廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分析 項目 百分率%外界帶入雜菌（取樣、補料） 8.20設備穿孔

14、 7.60空氣系統(tǒng)有菌 26.00停電罐壓跌零 1.60接種 11.00蒸汽壓力不足或蒸汽量不足 0.60管理問題

15、 7.80 操作違反規(guī)程 1.60種子帶菌 0.60原因不明 35.00,染菌的原因有多種，對于實際情況如何分析呢？單罐染菌不是系統(tǒng)問題，而

16、是該罐本身的問題。如種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、罐有滲漏、分過濾器失效多罐染菌系統(tǒng)問題，如空氣過濾系統(tǒng)有問題，特別是總過濾器長期沒有檢查，可能受潮失效；移種或補料的分配站有滲漏或滅菌不徹底,前期染菌種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底中后期染菌補料的料液滅菌不徹底或補料管道、閥門滲漏，一般不會是種子問題,檢查與判斷表觀法：溶氧水平排氣中CO2實驗法：鏡檢法平皿劃線或斜面檢查法肉湯培養(yǎng)法,1）防止種子帶菌,4 染菌的預防,

17、種子帶菌的原因滅菌不徹底(如假壓)；移種污染；養(yǎng)或保藏過程中污染；無菌室管理不善；,制備壯、純、量足的種子是發(fā)酵成功的關鍵，為此： 強化無菌室的管理(使用前滅菌)； 嚴格接種、移種的無菌操作； 在擴培各階段定時取樣做無菌實驗； 嚴格接種管滅菌，并用無菌空氣保壓；,無菌狀況的檢測,環(huán)境無菌的檢查塵埃粒子檢測無菌平板檢測,無菌室要求,打開紫外燈，照半小時，關燈后15分鐘再接種。 消毒藥水擦桌子、拖地，開啟超凈臺的通風，

18、 接種時必須在超凈臺上操作，保證無菌條件。 接種人員必須穿好無菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干凈。,種子及發(fā)酵液無菌狀況檢測,梭狀芽孢桿菌,雙球菌,,,2）防止空氣引起的染菌流程或設備設計的合理性；過慮介質(zhì)選用、裝填；過慮介質(zhì)的滅菌和管理；從日本工業(yè)技術院和上海第四制藥廠分析空氣帶菌而造成的染菌分別為19.96％和 26%?？諝獬到y(tǒng)復雜，環(huán)節(jié)多，偶遇不慎便會導致空氣除菌失敗。,空氣過濾除菌設備流程,空壓機,儲罐,二級冷卻

19、,加熱器,空氣過濾,粗過濾,空氣冷卻器的列管穿孔泄露，冷卻水會滲入到空氣中，造成染菌。棉花-活性炭過濾器長期使用后變薄的一邊失效。過濾介質(zhì)受潮失效：過濾器滅菌完畢應立即緩慢通入壓縮空氣，將水分吹干。超細纖維紙作過濾介質(zhì)，滅菌時必須將管道中冷凝水放干凈，以免介質(zhì)受潮失效。 在生產(chǎn)實踐中，空氣管道大多與其它物料管道相接，要裝上止逆閥防止其它物料竄入空氣管道污染過濾器，導致過濾介質(zhì)失效。,3）防止培養(yǎng)基滅菌不徹底,培養(yǎng)基滅菌方

20、法——高壓蒸汽滅菌分批滅菌 121℃，30分鐘連續(xù)滅菌 罐溫125－130℃ ，30－45分鐘,空氣凈化系統(tǒng),連續(xù)滅菌設備流程,連 消 塔,滅菌技術好壞與滅菌質(zhì)量相關蒸汽通入培養(yǎng)基，升溫快慢、保溫時間——產(chǎn)生過多泡沫蒸汽總壓是否達到要求標準雜菌數(shù)量：季節(jié)、原材料儲存和保管設備的清洗質(zhì)量、有無滅菌的死角,,為什么蒸汽滅菌時會產(chǎn)生大量泡沫呢？ 培養(yǎng)基和水的傳熱系數(shù)比空氣的傳熱系數(shù)大，如果滅菌時升

21、溫太快，培養(yǎng)基急劇膨脹，發(fā)酵罐內(nèi)的空氣排出較慢，就會產(chǎn)生大量泡沫，泡沫上升到發(fā)酵罐頂，泡沫中的耐熱菌就不能與蒸汽直接接觸，未被殺死。防止方法：緩慢開啟蒸汽閥門，或加入消泡劑,培養(yǎng)基滅菌不徹底原因蒸氣壓力或蒸氣量不足、滅菌時間不夠；滅菌時培養(yǎng)基產(chǎn)泡沫或罐內(nèi)有污垢堆積、或基質(zhì)中有不溶解的固體顆粒；蒸汽短路(1)原料性狀：(2)假壓的形成；(3)參數(shù)不穩(wěn)定（連續(xù)滅菌）；(4)設備死角(下圖) ；,生產(chǎn)上常把不能徹底滅菌的部位

22、稱為“死角”,不銹鋼襯里破裂造成“死角”,發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢,罐底的加強板,法蘭的“死角”a—墊圈內(nèi)徑過?。籦—墊圈內(nèi)徑過大；c—法蘭不平造成的泄漏與“死角”,a,b,c,滅菌時蒸汽不易通達的“死角”及其消除方法,壓力表安裝不合理形成“死角”1,6—發(fā)酵罐；2—緩沖管；3,4—壓力表；5—旋塞,消滅死角減少擋板和開孔；焊接光滑；法蘭、閥門連接正好；減少殘渣沉積；嚴格清洗和檢查；,定期檢修易壞部件,化學腐蝕,電化學腐蝕,磨

23、蝕,設備加工不良,,4） 防止設備滲漏 包括夾套穿孔、盤管穿孔、接種管穿孔、閥門滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設備漏等。,防止設備滲漏肉眼可見——冷卻盤管、夾套穿孔、閥門滲漏……肉眼不可見——試漏 水壓試漏法 集氣桶來試漏,5）加強操作和衛(wèi)生管理 嚴格操作規(guī)程、保持環(huán)境干凈。提高操作人員素質(zhì)溫度壓力的維持培養(yǎng)基、傳感器,6） 噬菌體污染及其防治措施染噬菌體對發(fā)酵的影響產(chǎn)生噬菌體的原

24、因：自然界中的噬菌體在活菌體中大量生長。隨著風沙塵土和空氣流動傳播，以及人們的走動、車輛的往來也攜帶著噬菌體到處傳播，使噬菌體潛入生產(chǎn)各個環(huán)節(jié)，尤其是通過空氣系統(tǒng)進入種子室、種子罐、發(fā)酵罐。,染噬菌體表現(xiàn)為：鏡檢pH值發(fā)酵液能力：殘?zhí)?、產(chǎn)物濃度發(fā)酵液性質(zhì)：泡沫、粘度、氣味OD值CO2，O2,噬菌體的檢測方法雙層瓊脂法：在培養(yǎng)皿上倒入培養(yǎng)生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基（加瓊脂）作下層。同樣的培養(yǎng)基中加入20％～30％培養(yǎng)好的種子液，再加入懷

25、疑染噬菌體的發(fā)酵液，搖均勻后，鋪上層。培養(yǎng)過夜觀察培養(yǎng)皿上是否出現(xiàn)噬菌斑。也可以在上層培養(yǎng)基中不加懷疑染噬菌體的發(fā)酵液，而將發(fā)酵液直接點種在上層培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)過夜，觀察有無透明圈出現(xiàn)。,噬菌體的防治 車間設計 地面環(huán)境衛(wèi)生 嚴格無菌操作認真進行發(fā)酵罐、補料系統(tǒng)的滅菌廢液滅菌排放選育抗噬菌體的菌種，或輪換使用菌種,T4的感染過程,吸附,侵入,復制與聚集,成熟與釋放,,感染T4后的異?，F(xiàn)象：OD值不升反降；耗糖速度降低；氨氮

26、大量釋放；,T4感染的防治凈化環(huán)境；光潔地面；嚴禁活排；消除死角；無菌室少與外界接觸；使用無T4的菌株；嚴格種檢；加強管理；,改變菌株或篩選抗T4的菌株；藥物防治(利用藥物使T4失活)：(1)螯合劑：抑制吸附或阻止注入；(2)抗生素：抑制T4蛋白質(zhì)的合成；(3)表面活性劑：抑制T4的吸附；(4)N-脂酰氨基酸：抑制T4復制或子代成熟；(5)聚胺類衍生物：與T4DNA結(jié)合，使T4失活；,5 染菌后的挽救措施

27、 染菌時間 染菌程度 最大效益,（1）種子培養(yǎng)期染菌,染菌的特點：生產(chǎn)菌少，防御雜菌能力低，容易污染雜菌。染菌后的處理：全部廢棄培養(yǎng)液,（2）發(fā)酵前期染菌,發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。原因 發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競爭優(yōu)勢；且還未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。染菌措施 補救培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補加一些營養(yǎng)，重新接種再用。,（3）發(fā)酵中期染菌,影響干擾產(chǎn)生菌的代謝改變發(fā)酵

28、液環(huán)境措施 降溫培養(yǎng)，減少補料提前放罐串罐,（4）發(fā)酵后期染菌,已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對雜菌有一定的抑制或殺滅能力。措施：染菌不多，對生產(chǎn)影響不大染菌嚴重，破壞性較大，可提前放罐,（5）T4感染后的挽救并罐法更換菌種：輪換菌株、抗性菌株放罐重消，補料，接種罐內(nèi)滅菌,染菌的善后培養(yǎng)基必須滅菌后才可放下水道。 滅菌方法：蒸汽滅菌，也可加入過氧乙酸等化學滅菌劑攪拌半小時，才放下水道。找到染菌

29、的原因，對癥下藥，徹底清洗消毒。染菌厲害時，車間環(huán)境要用石灰消毒，空氣用甲醛熏蒸。特別，若染噬菌體，空氣必須用甲醛蒸汽消毒。,小 結(jié),染菌對發(fā)酵的危害：干擾生產(chǎn)菌的正常代謝，降低產(chǎn)量改變pH，降解某些產(chǎn)物污染不同的微生物，不同階段染菌危害,染菌對提煉的危害：沉淀出過多雜質(zhì)過濾困難而大幅度降低過濾收率有機溶劑萃取時發(fā)生乳化,設備滲漏空氣帶菌種子帶菌滅菌不徹底技術管理不善,發(fā)酵液必須滅菌后才可放下水道

30、尋找染菌的原因染菌厲害時，車間環(huán)境要用石灰消毒,產(chǎn)生噬菌體的原因活菌體隨意排放，造成噬菌體的感染源,噬菌體的防治,危害：造成斷種，無法生產(chǎn),,建立工廠環(huán)境清潔衛(wèi)生制度感染噬菌體的培養(yǎng)物不得帶入菌種室、搖瓶間發(fā)現(xiàn)噬菌體停攪拌、小通風，將發(fā)酵液加熱到70~80℃殺死噬菌體，才可排放。環(huán)境用漂白粉消毒選育抗噬菌體的菌種,思考題染菌對發(fā)酵有什么危害，對提煉有什么危害？有哪些原因會引起染菌？染菌以后應采取什么措施？ 為什么會感