斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程中RBL和下游 Chk1基因的生物學(xué)功能分析.pdf

1、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）又稱為黑虎蝦，作為世界三大養(yǎng)殖蝦類之一。是目前世界上普遍養(yǎng)殖的優(yōu)良種類。斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖業(yè)中仍然通過單側(cè)眼柄切除技術(shù)促進雌蝦卵巢成熟和產(chǎn)卵。然而，該技術(shù)會導(dǎo)致親蝦高死亡率和產(chǎn)卵質(zhì)量低等問題。為了尋找一種替代方法，必須了解斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的機理，尤其是分子機理。本研究以斑節(jié)對蝦為研究對象，從本實驗室轉(zhuǎn)錄組中篩選出PmRBL和PmChk1 cDNA片段，利用SMART-RACE等分子生物學(xué)技術(shù)克隆得到了

2、它們的基因全長，克隆了PmChk1基因組全長，對PmChk1進行體外重組表達、蛋白純化和制備抗體，對PmRBL和PmChk1進行雙鏈RNA干擾檢測相關(guān)基因的表達，此外還研究了兩種蛋白在各組織、卵巢各期、注射5-HT和切眼柄后卵巢的表達量。我們比較系統(tǒng)的探究了斑節(jié)對蝦PmRBL和PmChk1的生物學(xué)信息和蛋白功能，為后續(xù)深入研究斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的分子機理提供依據(jù)。主要研究總結(jié)如下：
　　（1）轉(zhuǎn)錄組中篩選出PmRBL cDNA片段，

3、使用RACE技術(shù)克隆了斑節(jié)對蝦RBL基因全長，利用不同軟件進行序列生物信息學(xué)分析。PmRBL cDNA序列全長4,069 bp,包含54 bp的5′-untranslated region(UTR)，772 bp的3′UTR和可以編碼1,080個氨基酸的3,243 bp開放閱讀框，理論分子量為121.76 kDa。多重序列比對顯示PmRBL基因有一個保守的Rb-A結(jié)構(gòu)域(393–588 aa)和CYCLIN結(jié)構(gòu)域(781–918 aa)

4、。樹狀圖描述了基于不同物種Rb蛋白相似性的進化關(guān)系，脊椎動物Rb蛋白聚為一支，斑節(jié)對蝦和包含凡納濱對蝦的無脊椎動物聚為一支。qRT-PCR結(jié)果分析表明 PmRBL廣泛分布于斑節(jié)對蝦各個組織，其中在鰓中的轉(zhuǎn)錄表達量最高，肝胰腺和卵巢次之，腦中轉(zhuǎn)錄表達量最低。PmRBL的轉(zhuǎn)錄表達量在卵巢發(fā)育III期最高，其次是IV和V期，I和II期表達量最低。PmRBL的表達量在卵巢發(fā)育III， IV和V期顯著高于I和II期。注射5-HT12-96 h后，

5、PmRBL在卵巢中的表達量顯著上調(diào)。PmRBL在切除眼柄后3-96 h斑節(jié)對蝦卵巢中的轉(zhuǎn)錄表達量顯著上調(diào)。注射 dsRNA-RBL成功的沉默了卵巢和肝胰腺中的PmRBL。原位雜交實驗檢測PmRBL在斑節(jié)對蝦肝胰腺中的表達位點和表達量，原位雜交的結(jié)果和定量檢測結(jié)果是一致的。注射dsRNA-RBL6-24 h后，PmCDC2和PmCyclin B在肝胰腺和卵巢中的表達量顯著降低。PmRBL在注射dsRNA-p5312-96 h后斑節(jié)對蝦卵巢

6、和肝胰腺中的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。注射 dsRNA-RBL后的性腺指數(shù)顯著低于注射dsRNA-GFP后的對照組。結(jié)果表明，在斑節(jié)對蝦的卵巢發(fā)育過程中PmRBL起正調(diào)控作用。
　?。?）轉(zhuǎn)錄組中篩選出PmChk1 cDNA片段，使用RACE技術(shù)克隆了斑節(jié)對蝦Chk1基因全長。PmChk1 cDNA序列全長3,334 bp,包含249 bp的5′-untranslated region(UTR)，1,630 bp的3′UTR和可以編碼48

7、4個氨基酸的1,455 bp開放閱讀框，理論分子量為54.61 kDa。PmChk1完整基因組有11,081 bp含有10個外顯子和9個內(nèi)含子。重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點包括：3個IRF1、2個SREBP、NF-kB、ISGF3、HNF4、STAT1、PPAR、TATA-box和CpG島。多重序列比對顯示PmChk1有一個保守的S-TKc結(jié)構(gòu)域(12–270 aa)。斑節(jié)對蝦Chk1和蚤狀溞Chk1有55％的相似性，分析表明斑節(jié)對蝦Chk1

8、氨基酸序列和蚤狀溞最相近。樹狀圖描述了基于不同物種Chk1蛋白相似性的進化關(guān)系，脊椎動物Chk1蛋白聚為一支，斑節(jié)對蝦Chk1和包含蚤狀溞Chk1的無脊椎動物聚為一支。qRT-PCR結(jié)果分析表明PmChk1廣泛分布于斑節(jié)對蝦各個組織，其中在卵巢，鰓和腦中的表達較高，肌肉中轉(zhuǎn)錄水平表達最低。PmChk1在卵巢發(fā)育I和II期表達量最高，III期轉(zhuǎn)錄水平最小。PmChk1的轉(zhuǎn)錄水平在籽蝦期最高，在受精卵期最低。注射5-HT和DA24-96 h

9、后，PmChk1在卵巢中的表達量分別降低和升高。切除眼柄后3-96 h，PmChk1在卵巢中的表達量顯著下調(diào)。注射dsRNA-Chk1成功的沉默了卵巢和肝胰腺中的PmChk1。原位雜交實驗檢測PmChk1在肝胰腺和卵巢中的表達位點和表達量，原位雜交的結(jié)果和定量檢測結(jié)果是一致的。檢測注射dsRNA-Chk1和dsRNA-GFP卵巢組織酶活，注射dsRNA-Chk124h-72 h后，Chk1組織酶活性顯著低于對照組。免疫印跡實驗表明注射d

10、sRNA-Chk1后24和48 h PmChk1蛋白表達量與注射dsRNA-GFP后24和48 h對比明顯減少。PmCDC2和PmCyclin B在注射dsRNA-Chk16-72 h后斑節(jié)對蝦肝胰腺和卵巢中的表達量顯著升高。PmChk1在注射dsRNA-p5312-96 h后斑節(jié)對蝦卵巢和肝胰腺中的表達量顯著上調(diào)，PmChk1在注射dsRNA-RBL6-96 h后斑節(jié)對蝦卵巢和肝胰腺中的表達量顯著上調(diào)。注射dsRNA-Chk1后的性腺

11、指數(shù)顯著高于注射dsRNA-GFP和PBS后的對照組。結(jié)果表明，在斑節(jié)對蝦的卵巢發(fā)育過程中PmChk1起負(fù)調(diào)控作用。
　　本研究分析了 PmRBL和 PmChk1基因的序列特征，qRT-PCR技術(shù)檢測到PmRBL和PmChk1基因的mRNA在斑節(jié)對蝦各個組織組織中均有表達只是表達量存在差異，在卵巢發(fā)育的各期相對表達水平不同，RNA干擾、原位雜交、組織酶活和免疫印跡技術(shù)檢測到PmRBL和PmChk1基因在信號通路中是上下游的關(guān)系，R