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文檔簡介
1、目的:
課題組前期研究發(fā)現(xiàn)傷寒沙門菌sufC及t4606基因的表達(dá)受兩個重要的調(diào)節(jié)因子RpoE和RpoS的雙重調(diào)控,推測其可能在傷寒沙門菌致病過程中發(fā)揮重要作用。sufC在其他腸道致病菌中對鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)重要,參與細(xì)菌對抗宿主細(xì)胞的氧化應(yīng)激;傷寒沙門菌t4606基因編碼一未知功能的蛋白質(zhì),對其基因序列分析發(fā)現(xiàn)具有Patatin-like phospholipase的功能基序,本研究旨在對sufC基因及t4606基因在傷寒沙門
2、菌中的功能進(jìn)行鑒定,揭示兩者在傷寒沙門菌致病過程中的作用。
方法:
一、傷寒沙門菌sufC功能研究
(1) sufC基因缺陷變異株的制備:用特異性引物擴(kuò)增帶有sufC基因上下游同源臂的卡那霉素抗性基因片段,將其電轉(zhuǎn)至含pKD46的傷寒沙門菌野生株,利用λ-Red系統(tǒng)制備sufC的基因缺陷株。
(2) sufC基因缺陷回補(bǔ)株的制備:構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYC184-sufC,將其及pACYC184空質(zhì)粒
3、導(dǎo)入sufC基因缺陷株,制備sufC基因的缺陷回補(bǔ)株及空質(zhì)?;匮a(bǔ)對照株。
(3)生長曲線的測定:分別測定S. Typhi野生株、sufC基因缺陷株、sufC基因缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)?;匮a(bǔ)對照株在正常條件、高滲應(yīng)激、酸和氧應(yīng)激條件下的生長曲線,比較各菌株的生長差異。
(4) sufC基因缺陷株的上皮細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):將傷寒沙門菌野生株、sufC基因缺陷變異株及其回補(bǔ)株和空質(zhì)粒回補(bǔ)對照株培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD6000.4),分別
4、感染HeLa細(xì)胞(MOI均為10),分析各菌株對上皮細(xì)胞侵襲力的差異。
(5) sufC基因缺陷株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存實(shí)驗(yàn):將傷寒沙門菌野生株、sufC基因缺陷變異株及其回補(bǔ)株和空質(zhì)粒回補(bǔ)對照株培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD6000.4),分別感染THP-1巨噬細(xì)胞(MOI均為10),比較各菌株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力差異,同時(shí)在細(xì)菌感染巨噬細(xì)胞的不同時(shí)間點(diǎn)測定上清液中巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平。
二、傷寒沙門菌t4606基
5、因功能研究
(1) t4606基因缺陷變異株的制備:構(gòu)建t4606基因缺損型同源核苷酸片段,采用自殺質(zhì)粒pGMB151介導(dǎo)的同源重組方法制備傷寒沙門菌t4606缺陷變異株。
(2) t4606基因缺陷回補(bǔ)株的制備:構(gòu)建重組質(zhì)粒pBAD-t4606,將其及空質(zhì)粒pBAD分別導(dǎo)入t4606基因缺陷變異株,制備sufC基因缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)?;匮a(bǔ)對照株。
(3)生長曲線測定:測定S. Typhi野生株、t4606基
6、因缺陷株、t4606基因缺陷回補(bǔ)株、空質(zhì)?;匮a(bǔ)對照株在普通條件、高滲應(yīng)激、酸應(yīng)激和氧應(yīng)激條件下的生長曲線,比較各菌株的生長差異。
(4) t4606基因缺陷株的上皮細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),方法同上述傷寒沙門菌t4606基因缺陷株的上皮細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。
(5) t4606基因缺陷株在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存實(shí)驗(yàn),方法同上述傷寒沙門菌t4606基因缺陷株的胞內(nèi)生存實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果:
(1)經(jīng)PCR及序列分析驗(yàn)證,成功制備了傷寒
7、沙門菌sufC、t4606基因缺陷株及其回補(bǔ)株和空質(zhì)?;匮a(bǔ)對照株。
(2)生長曲線表明,sufC缺陷株在普通條件和高滲應(yīng)激條件下與野生株的生存能力無明顯差異,而在氧應(yīng)激條件下,sufC缺陷株的生長明顯遲緩于野生株,回補(bǔ)sufC基因至sufC缺陷株后,回補(bǔ)株的生長恢復(fù)至野生株水平。
(3)與野生株相比,sufC缺陷株對上皮細(xì)胞的侵襲力明顯減弱。
(4)與野生株相比,sufC缺陷株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力明顯減弱
8、;野生株與sufC缺陷株感染巨噬細(xì)胞后,細(xì)胞培養(yǎng)上清中均有細(xì)胞因子TNF和IL-6的表達(dá),但在sufC缺陷株中TNF和IL-6的表達(dá)水平均明顯低于野生株。
(5)在普通生長條件和氧應(yīng)激條件下,t4606的缺失對傷寒沙門菌的生長無影響,但在高滲應(yīng)激條件下,t4606缺陷株的生長明顯遲緩于野生株,回補(bǔ)t4606基因至t4606缺陷株后,回補(bǔ)株的生長恢復(fù)至野生株水平。
(6)與野生株相比,t4606缺陷株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存
9、能力及其對hela細(xì)胞的侵襲力無明顯差異。
結(jié)論:
通過兩種細(xì)菌基因缺失制備系統(tǒng),我們成功制備了傷寒沙門菌sufC和t4606基因缺陷株及其回補(bǔ)株和空質(zhì)?;匮a(bǔ)對照株。本研究表明,sufC基因有助于傷寒沙門菌在氧應(yīng)激環(huán)境下的生長,促進(jìn)傷寒沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活,且明顯增強(qiáng)傷寒沙門菌對上皮細(xì)胞的侵襲力,提示sufC基因?qū)τ趥抽T菌在致病過程中的侵襲和胞內(nèi)生存兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有重要的促進(jìn)作用。同時(shí),t4606基因促進(jìn)傷寒
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