紅鰭東方鲀低溫轉(zhuǎn)錄組基因差異表達(dá)分析及系譜認(rèn)證研究.pdf

1、紅鰭東方鲀是我國(guó)北方的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種，為了提高種質(zhì)質(zhì)量，減少養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)損失，實(shí)驗(yàn)從紅鰭東方鲀系譜認(rèn)證、耐寒基因篩選及低溫相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制開展相關(guān)研究。利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析等對(duì)紅鰭東方鲀養(yǎng)殖家系進(jìn)行科學(xué)研究。
　　選取18℃、8℃、5℃脅迫下的肝臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway分析，結(jié)果顯示差異基因主要集中在新陳代謝通路，而且在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸和代謝方面差異基因存

2、在較多。通過(guò)GO功能顯著性富集分析，結(jié)果顯示隨著溫度降低，與分子功能有關(guān)的部分消化酶活性均有不同程度的下調(diào)，這在一定程度上對(duì)魚類自身機(jī)體的代謝強(qiáng)度產(chǎn)生了相關(guān)影響，酶活與調(diào)節(jié)機(jī)制代謝，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有著重要的聯(lián)系作用。在溫度下降的過(guò)程中，鐵離子的結(jié)合和血紅素的結(jié)合能力也呈下調(diào)趨勢(shì)，這與低溫環(huán)境下魚類的活動(dòng)減弱有著密不可分的關(guān)系。在低溫脅迫下，魚類活動(dòng)減弱，呼吸變慢，吸入魚體內(nèi)部的氧氣也隨之減少，整個(gè)魚體的溶氧情況對(duì)魚體自身也起了一定的調(diào)節(jié)作用

3、，魚體在低溫條件下，大部分的能量作為熱能來(lái)平衡體內(nèi)內(nèi)環(huán)境與外界水溫造成的溫度差，鰓呼吸現(xiàn)象減弱，使得水中的氧氣擴(kuò)散到血液中的機(jī)會(huì)變少，機(jī)體細(xì)胞受到一定損傷，細(xì)胞膜通透性變大，于是外界離子進(jìn)入體內(nèi)，使得鐵離子的結(jié)合能力降低。隨著溫度的下降，DNA結(jié)合、RNA結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferase，PRMTs）及核心啟動(dòng)子序列結(jié)合相關(guān)的調(diào)控均呈上升趨勢(shì)，我

4、們認(rèn)為這與相關(guān)蛋白功能的調(diào)控有密切關(guān)系，如蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶已發(fā)現(xiàn)在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控、蛋白質(zhì)的拼接及組裝、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)方面發(fā)揮著重要作用。
　　為了研究紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)相關(guān)耐低溫機(jī)制，利用實(shí)時(shí)熒光定量（qPCR）技術(shù)，分析抗凍蛋白（AFP）、冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（CIRP）、高速遷移蛋白家族蛋白（HMGB1）、Y-box結(jié)合蛋白在溫度18℃、13℃、8℃，5℃脅迫下，紅鰭

5、東方鲀肝、脾、腎、腦、心、腸、肌肉、性腺，皮中的基因表達(dá)的情況。據(jù)結(jié)果可知，4個(gè)基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，AFP基因在各組織中的表達(dá)量整體呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，在5℃時(shí)AFP基因在各組織中的表達(dá)量均達(dá)到最大，相比對(duì)照組表達(dá)量差異顯著升高（P＜0.05）；CIRP基因在心、腸，皮的表達(dá)量隨溫度降至8℃時(shí)達(dá)到最大，在5℃時(shí)表達(dá)量有所降低，其中腸中CRIP基因的表達(dá)量在13℃、8℃，5℃時(shí)的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），在脾、肌肉，性腺中，

6、 CIRP基因的表達(dá)量隨溫度的下降而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并均在5℃時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；HMGB1基因在各個(gè)組織中的表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)，并在脾、腎、腦、心、腸，性腺中的表達(dá)量均與對(duì)照組形成顯著性差異（P＜0.05），且在8℃時(shí)表達(dá)量達(dá)最大值，溫度從8℃降到5℃時(shí)，HMGB1在各組織中的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)；Y-box基因在不同溫度下的各個(gè)組織中均有表達(dá)，在5℃時(shí)，Y-box在組織脾，腸，性腺中其表達(dá)量明顯高于對(duì)照組形

7、成顯著性差異（P＜0.05），在8℃時(shí)，Y-box在肌肉中的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組18℃（P＜0.05），13℃時(shí)，Y-box基因在脾、腎、腦、腸，性腺中的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組18℃（P＜0.05）。從結(jié)果得知，紅鰭東方鲀AFP1基因和HMGB1基因與溫度存在一定的相關(guān)性，說(shuō)明AFP1基因和HMGB1基因在紅鰭東方鲀低溫脅迫下機(jī)體對(duì)冷刺激的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的作用，CIRP基因和Y-box基因雖有不同程度的表達(dá)，但未發(fā)現(xiàn)明顯變化規(guī)律，可能與基

8、因?qū)Φ蜏孛{迫下作出的應(yīng)答機(jī)制較為復(fù)雜有密切的關(guān)系。
　　本研究從2015年所建的12個(gè)紅鰭東方鲀家系中隨機(jī)選取5個(gè)家系，針對(duì)5個(gè)紅鰭東方鲀家系，利用8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析和系譜認(rèn)證。8個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)得到32個(gè)等位基因。每個(gè)位點(diǎn)等位基因范圍從3到6，平均值為4。平均觀測(cè)雜合度范圍從0.4533到0.9533，平均期望雜合度范圍從0.4908到0.7901，平均多態(tài)信息含量范圍從0.4555到0.7546。不同位點(diǎn)共發(fā)現(xiàn)8

9、個(gè)家系特異性等位基因，7＃家系發(fā)現(xiàn)3個(gè)，3＃和11＃家系各發(fā)現(xiàn)2個(gè)，12＃家系發(fā)現(xiàn)1個(gè)，10＃家系未發(fā)現(xiàn)特異性等位基因。根據(jù)子代基因型成功推斷出5個(gè)家系的親本基因型，據(jù)此鑒別各個(gè)家系。在fms15位點(diǎn)，可將3＃和11＃家系與其他家系相區(qū)別；TOG01位點(diǎn)可將7＃家系與其他家系相區(qū)別；f1497位點(diǎn)可將12＃家系相區(qū)別。因此，fms15，TOG01，f1497這三對(duì)標(biāo)記可以作為鑒別5個(gè)家系的特異性標(biāo)記。結(jié)果說(shuō)明，所選的8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在這5

10、個(gè)家系中多態(tài)信息含量較高，且在已選用的8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中，最少用3個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記可鑒別5個(gè)紅鰭東方鲀家系。運(yùn)用相同方法，我們采用7對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)暗紋東方鲀遺傳多樣性進(jìn)行分析和系譜認(rèn)證。7個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)得到29個(gè)等位基因。每個(gè)位點(diǎn)等位基因范圍從3到6，平均值為4.1。平均觀測(cè)雜合度范圍從0.4917到0.9583，平均期望雜合度范圍從0.5270到0.7691,平均多態(tài)信息含量范圍從0.4669到0.7272。不同位點(diǎn)共發(fā)現(xiàn)3個(gè)家系特異性等位基