紅鰭東方鲀IFN-γ基因的重組表達(dá)及其免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、干擾素γ(interferon-gama,IFN-γ)是一類由特定免疫細(xì)胞分泌的多功能蛋白質(zhì)。IFN-γ屬于Ⅱ型干擾素，溫度穩(wěn)定性及耐酸性較差，易失活。但I(xiàn)FN-γ具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抗病毒、抗寄生蟲(chóng)感染、調(diào)節(jié)機(jī)體特異性免疫等功能，目前已將重組IFN-γ生物制劑應(yīng)用于人乙型、丙型肝炎的治療過(guò)程并取得了良好的治療效果。因此，IFN-γ在治療病毒性疾病、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力方面具有良好的應(yīng)用前景。魚(yú)類干擾素研究雖起步相對(duì)較晚，但成果較為顯著，已

2、通過(guò)基因工程等方法獲得多種魚(yú)的IFN基因及重組蛋白。
　　本研究是利用基因工程方法構(gòu)建重組工程菌獲得具有生物學(xué)活性的重組蛋白。從NCBI獲得紅鰭東方鲀干擾素γ基因ORF序列，利用生物學(xué)軟件分析其序列特征，獲得成熟肽序列。根據(jù)密碼子偏愛(ài)性對(duì)紅鰭東方鲀IFN-γ成熟肽序列進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的序列與質(zhì)粒pPICZαA相連，雙酶切鑒定。利用限制性內(nèi)切酶SacⅠ將重組質(zhì)粒進(jìn)行線性化，電轉(zhuǎn)化整合到畢赤酵母GS115基因組中。用含有高濃度Zeoc

3、in的培養(yǎng)基進(jìn)行高拷貝菌株的篩選，BMGY/BMMY液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)獲得分子量約為24kDa的重組紅鰭東方鲀IFN-γ蛋白粗品。細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)重組IFN-γ蛋白活性為2018U/mL。將不同稀釋度的重組蛋白液與標(biāo)準(zhǔn)品分別刺激受病毒感染的WISH細(xì)胞，測(cè)定各濃度下WISH細(xì)胞吸光度值并繪制增殖曲線，結(jié)果表明，重組紅鰭東方鲀IFN-γ蛋白能夠抑制病毒感染并促進(jìn)WISH細(xì)胞增殖，與干擾素標(biāo)準(zhǔn)品具有

4、一致的趨勢(shì)。
　　利用實(shí)驗(yàn)室已有的原核表達(dá)菌株進(jìn)行紅鰭東方鲀IFN-γ的重組表達(dá)，獲得濃度為0.346mg/mL的重組IFN-γ蛋白，并對(duì)其效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果證明原核表達(dá)的重組IFN-γ蛋白活性效價(jià)為1.7×105U/mL，比真核表達(dá)的重組IFN-γ蛋白活性高，該結(jié)果為后續(xù)免疫實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　以不同濃度(25μg/mL rIFNg-γ為實(shí)驗(yàn)組1、50μg/mL rIFNg-γ為實(shí)驗(yàn)組2)的原核表達(dá)的重組IFN-γ蛋白免疫

5、6月齡健康紅鰭東方鲀，PBS作為對(duì)照組，于腹腔注射后6、12、24、36h取腎臟組織。Trizol法提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx1基因特異性及其在腎臟組織內(nèi)不同時(shí)間的表達(dá)量差異。結(jié)果顯示，紅鰭東方鲀免疫后6-36h，IFN-α基因在實(shí)驗(yàn)組1中的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，24h時(shí)表達(dá)量最高；在實(shí)驗(yàn)組2中的表達(dá)量在6h最高，隨后呈下降趨勢(shì)。IFN-γ、MHCⅠ在免疫后6h

6、表達(dá)量都出現(xiàn)最大值且實(shí)驗(yàn)組1高于實(shí)驗(yàn)組2，隨后呈下降趨勢(shì)。Mx1基因的表達(dá)則出現(xiàn)上升趨勢(shì)，24h時(shí)表達(dá)量最高，隨后下降。
　　利用RNA-Seq分析紅鰭東方鲀PBS組和IFN-γ組腎組織轉(zhuǎn)錄組，共測(cè)得Raw datas分別為29,939,506和24,630,588。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾后分別得到的Clean reads為29,415,565和23,943,395。通過(guò)差異基因篩選得到292個(gè)差異基因，其中171個(gè)在IFN-γ組腎組織中