紅鰭東方鲀IL-2基因的重組表達(dá)及其免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）是重要海水養(yǎng)殖優(yōu)良魚(yú)種之一，由于肉嫩、味鮮、營(yíng)養(yǎng)好深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛(ài)。近年來(lái)，紅鰭東方鲀養(yǎng)殖規(guī)模及養(yǎng)殖密度逐步擴(kuò)大，導(dǎo)致魚(yú)類的發(fā)病幾率隨之增大。目前，用抗生素來(lái)治療疾病是最普遍的方式，但是使用抗生素不僅會(huì)使魚(yú)體產(chǎn)生抗性，而且還會(huì)帶來(lái)食品安全和生態(tài)安全問(wèn)題等問(wèn)題。隨著人類生活水平的提升，食品的安全性是決定該食品的市場(chǎng)前景的主要因素，因此采用生物防治的方法來(lái)提高魚(yú)類自身免疫能力十分必要。<

2、br>　　不同物種的重組白介素2產(chǎn)品研究已十分廣泛，例如重組人類白介素2已被應(yīng)用到臨床實(shí)踐中，雞鴨等禽類也有許多重組蛋白的問(wèn)世。但是重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的研究較少。本文以紅鰭東方鲀IL-2基因?yàn)榛A(chǔ)，分別針對(duì)大腸桿菌和畢赤酵母進(jìn)行密碼子優(yōu)化，分別針對(duì)pET-32a(+)和pPICZα-A載體設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)、信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)、標(biāo)簽序列和終止密碼子等，人工合成基因序列。
　　本研究分別使用原核表達(dá)和真核表達(dá)兩種方法獲得重組紅鰭東方鲀

3、白介素2蛋白。原核表達(dá)中選用大腸桿菌BL-21（DE3）作為宿主菌株，將重組表達(dá)載體pET-32a(+)-IL-2轉(zhuǎn)化至宿主菌體后，37℃培養(yǎng)菌液至其OD值為0.4-0.6左右，低溫緩慢誘導(dǎo)過(guò)夜（IPTG濃度1mM/ml），所得重組蛋白為可溶性蛋白且分子量與預(yù)期大小相符（32.5KDa）。利用組氨酸標(biāo)簽與鎳離子之間高度親和，高濃度的咪唑可與組氨酸標(biāo)簽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鎳離子的原理純化重組蛋白。腸激酶酶切重組蛋白，最適酶切條件為每mg蛋白IU腸激酶

4、，37℃酶切16小時(shí)。
　　真核表達(dá)中選用的是畢赤酵母GS115作為宿主菌株，將重組表達(dá)載體pPICZα-A-IL-2通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至GS115菌株感受態(tài)細(xì)胞中，用含不同濃度zeocin的平板選擇高拷貝菌株，將其在28℃培養(yǎng)至OD600至2-6左右后更換培養(yǎng)基，同樣溫度條件下培養(yǎng)，每隔24小時(shí)向培養(yǎng)基中添加一次甲醇，經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，甲醇終濃度為1.5％，誘導(dǎo)96小時(shí)表達(dá)量可達(dá)到最大，所得蛋白分子量大小約為14KDa。

5、r>　　通過(guò)MTT法鑒定重組蛋白生物學(xué)活性。結(jié)果顯示，兩種方法得到的重組蛋白均能夠在體外促進(jìn)小鼠T淋巴細(xì)胞（CTLL-2）的增值，原核表達(dá)所得重組蛋白經(jīng)純化后生物學(xué)活性最高，酶切后的樣品次之；真核表達(dá)所得重組蛋白經(jīng)濃縮后生物活性最高。
　　原核表達(dá)制備重組蛋白具有成本低、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短等優(yōu)勢(shì)，因此本研究中選擇原核表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行免疫應(yīng)答實(shí)驗(yàn)。兩實(shí)驗(yàn)組樣品濃度分別為0.025ug/ul和0.05ug/ul，PBS作對(duì)照，每尾注射