2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、自噬是細胞本身通過溶酶體降解途徑來清除細胞質中蛋白大分子和細胞器的一種在進化上高度保守的現(xiàn)象。細胞在代謝應激條件下,細胞能夠通過自噬清除異常代謝物質,避免細胞病變、損傷以及變性的發(fā)生,因此,自噬在促進細胞存活中發(fā)揮重要作用。鎘是一種具有高毒性的工業(yè)和環(huán)境污染物,能夠對人和動物的健康造成損傷。近年來研究表明,鎘能夠通過血腦屏障進入腦組織,影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。臨床研究發(fā)現(xiàn),鎘能夠造成神經(jīng)行為缺陷,是導致兒童認知障礙和神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的

2、重要原因。體外研究表明,神經(jīng)細胞自噬在鎘引起的毒性損傷中具有保護作用。最新研究表明,神經(jīng)元衰老是導致神經(jīng)退行性疾病的重要原因之一。但是鎘對神經(jīng)細胞衰老影響以及自噬在神經(jīng)細胞衰老中的作用尚不明確。本研究擬采用PC12細胞和大鼠大腦皮質神經(jīng)元(原代神經(jīng)細胞)作為模型,通過體外實驗探討鎘誘導神經(jīng)細胞自噬發(fā)生的機制,研究自噬在鎘致神經(jīng)細胞衰老中的作用及調控機制,為揭示鎘致神經(jīng)細胞毒性機理提供科學依據(jù)。
  1.鎘對神經(jīng)細胞衰老的影響

3、>  為了研究鎘對神經(jīng)細胞衰老的影響,本實驗選用PC12細胞作為模型。用RTCA實時檢測技術監(jiān)測不同濃度醋酸鎘(0、2.5、5、10μmol/L)處理條件下PC12細胞的生長曲線,結果表明,與對照組細胞相比,10μmol/L Cd組細胞的細胞指數(shù)(CI)明顯下降。在一定的濃度和時間范圍內,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴和時間依賴效應,說明鎘對PC12細胞具有明顯的毒性作用;選用PC12細胞和原代神經(jīng)細胞作為模型,不同濃度醋酸鎘(0、5、10、20μ

4、mol/L)分別處理PC12細胞和原代神經(jīng)細胞24h后,統(tǒng)計PC12細胞β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量;qRT-PCR法檢測鎘對原代神經(jīng)細胞炎性因子IL1α、IL6基因表達的影響;蛋白免疫印跡法檢測PC12細胞衰老相關蛋白P53、P21、P16的表達;10μmol/L醋酸鎘處理PC12細胞不同時間(0、2、4、6、8、12、24 h),蛋白免疫印跡法檢測PC12細胞衰老相關蛋白的表達;10μmol/L醋酸鎘處理PC12細胞或原代神經(jīng)細胞2

5、4 h,通過對F-actin染色,觀察鎘對PC12細胞及原代神經(jīng)細胞骨架的影響;結果表明,與對照組相比,10μmol/L醋酸鎘處理PC12細胞24 h能夠極顯著增加表達β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量(P<0.01); PC12細胞或原代神經(jīng)細胞內F-actin結構受到明顯的損傷;PC12細胞P53、P21和P16衰老相關蛋白的表達顯著性升高(P<0.01)呈時間和劑量依賴關系;隨著鎘濃度的升高,原代神經(jīng)細胞炎性因子IL1α、IL6基因的表

6、達量逐漸升高呈劑量依賴關系(P<0.01)。提示鎘能促進神經(jīng)細胞衰老。
  2.自噬在鎘誘導神經(jīng)細胞衰老中的作用
  為了探討自噬在鎘誘導神經(jīng)細胞衰老中的作用,本研究采用自噬激活劑100 nmol/L雷帕霉素(RAP)預處理PC12細胞或原代神經(jīng)細胞24 h,用醋酸鎘處理24 h,統(tǒng)計β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量,結果顯示,與單獨染鎘組相比,RAP與鎘聯(lián)合處理組PC12細胞中β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量極顯著減少(P<0.0

7、1)。免疫印跡法檢測PC12細胞中P53、P21和P16相關蛋白的表達,與鎘單獨處理組相比,RAP與鎘共處理組P53、P21和P16衰老相關蛋白的表達水平極顯著性降低(P<0.01);RT-PCR法檢測原代神經(jīng)細胞IL1α、IL6基因的表達,結果顯示,RAP能夠抑制鎘引起的IL1α、IL6基因的表達(P<0.01)。通過采用自噬的抑制劑CQ或3-MA預處理PC12細胞0.5h,或采用Atg5 siRNA干擾技術抑制自噬,然后鎘處理細胞6

8、h,通過采用RTCA技術測定細胞細胞生長曲線,與鎘單獨處理6h組相比,添加CQ后能夠明顯降低PC12細胞指數(shù);免疫印跡結果顯示,與鎘單獨處理組相比,添加3-MA或轉染Atg5 siRNA均能夠促進衰老相關蛋白表達的增加。綜上說明自噬在鎘誘導的神經(jīng)細胞衰老中具有抑制作用。
  3.內質網(wǎng)應激在鎘誘導神經(jīng)細胞自噬中的作用
  為探討內質網(wǎng)應激在鎘誘導神經(jīng)細胞自噬中的作用,本研究選用PC12細胞和原代神經(jīng)細胞作為模型,10μmol

9、/L醋酸鎘分別處理PC12細胞和原代神經(jīng)細胞不同時間(0、2、4、6、8、12、24 h),免疫印跡法檢測內質網(wǎng)應激相關蛋白Bip、ATF4、CHOP、p-eIF2α的表達。結果顯示,10μmol/L醋酸鎘處理兩種細胞不同時間后,PC12細胞中CHOP蛋白隨著時間的延長,表達量逐漸升高,其余蛋白的表達在6h達到最高,然后逐漸降低。內質網(wǎng)應激抑制劑mithramycin與醋酸鎘單獨或聯(lián)合培養(yǎng)PC12細胞和原代神經(jīng)細胞6h,免疫印跡法檢測B

10、ip、LC3蛋白表達;通過間接免疫熒光染色,觀察Bip蛋白的表達及分布;將穩(wěn)定轉染有EGFP-RFP-LC3B基因的PC12細胞按照上述方法處理后,激光共聚焦觀察LC3聚點。結果表明,Mithramycin不但顯著抑制了鎘誘導的Bip蛋白的表達,同時還能明顯降低LC3-Ⅱ的表達水平(P<0.01)及LC3聚點。說明鎘能夠誘導神經(jīng)細胞內質網(wǎng)應激的發(fā)生,內質網(wǎng)應激在鎘誘導神經(jīng)細胞自噬中起到正調控作用。
  4.Bip/AMPK在鎘誘導

11、神經(jīng)細胞自噬與衰老中的作用
  為進一步說明內質網(wǎng)應激分子伴侶Bip在鎘誘導神經(jīng)細胞自噬與衰老中的作用,用BipsiRNA轉染PC12細胞抑制Bip基因表達,10μmol/L醋酸鎘分別處理陰性干擾(NC)組和Bip干擾(siBip)組細胞不同時間(0、2、6、24 h),試劑盒法檢測并統(tǒng)計β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量;免疫印跡法檢測相關蛋白Bip、LC3、P21的表達。結果顯示,與NC組相比,鎘處理siBip組6h后β-半乳糖苷酶

12、陽性細胞的數(shù)量極顯著增加(P<0.01); Bip、P-AMPK和LC3-Ⅱ蛋白表達量明顯下降,P21蛋白表達量明顯升高。鎘處理NC組Bip干擾siBip組細胞6h或鎘與Bip抑制劑BAPTA單獨或聯(lián)合作用細胞6h,激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內EGFP-RFP-LC3的表達及分布。結果顯示,與NC組細胞相比,鎘處理siBip細胞6h后,LC3黃色聚點明顯減少;與鎘單獨處理組相比,BAPTA與鎘聯(lián)合處理組細胞LC3黃色聚點明顯減少。為了探究

13、Bip在鎘激活AMPK/mTOR通路中的作用,不同濃度醋酸鎘(0、5、10、20μmol/L)處理PC12細胞或原代神經(jīng)細胞6h,結果表明,隨著鎘濃度的升高,P-AMPK表達量逐漸升高,呈劑量依賴關系;鎘與BAPTA單獨或聯(lián)合作用PC12細胞或原代神經(jīng)細胞6h,免疫印跡檢測P-AMPK表達,結果顯示,與鎘單獨處理組細胞相比,BAPTA與鎘聯(lián)合處理組細胞AMPK磷酸化水平極顯著性降低(P<0.01)。鎘處理NC細胞和siBip細胞6h,免

14、疫印跡檢測P-AMPK、P-AKT、P-S6K蛋白表達,與NC組細胞相比,鎘處理siBip組細胞P-AMPK蛋白表達水平降低,P-AKT、P-S6K蛋白表達水平升高。綜上說明Bip在鎘誘導的神經(jīng)細胞自噬與衰老以及在鎘激活AMPK通路中具有調節(jié)作用。
  5.ROS在鎘誘導原代神經(jīng)細胞自噬和衰老中的作用
  為了揭示ROS在神經(jīng)細胞自噬和衰老中的作用,本研究選用PC12細胞和原代神經(jīng)細胞為模型,10μmol/L鎘和ROS抑制劑

15、100 nmol/L NAC單獨或聯(lián)合處理PC12細胞或原代神經(jīng)細胞6h或24 h,結果顯示,與鎘單獨處理組相比,NAC與鎘聯(lián)合處理6h,PC12細胞中LC3Ⅱ蛋白的表達無明顯變化;20μmol/L鎘和100 nmol/L NAC單獨或聯(lián)合處理原代神經(jīng)細胞6h免疫印跡檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Atg5、Atg7表達(P<0.01)。為說明ROS在鎘誘導神經(jīng)細胞衰老中的作用,NAC與鎘聯(lián)合處理細胞24 h,與鎘單獨處理組相比,PC12細

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