表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gD基因與雞IL-2基因重組禽痘病毒的構(gòu)建及其免疫效力研究.pdf

1、雞傳染性喉氣管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT)是由傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)引起的雞的一種急性上呼吸道傳染病，本病給養(yǎng)雞業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前主要應(yīng)用致弱的喉氣管炎病毒作為弱毒疫苗，但是由于雞傳染性喉氣管炎弱毒疫苗株也能引起潛伏感染，并在雞群與雞群之間傳播過(guò)程中毒力會(huì)返強(qiáng)，從而成為新的感染源，因此，研究新型安全且有效的疫苗

2、用于ILT的防制十分必要.本文將ILTV河南長(zhǎng)葛株的gD基因與雞IL-2基因重組禽痘病毒轉(zhuǎn)移載體，得到一株重組病毒。試驗(yàn)研究主要從以下幾個(gè)方面展開(kāi)： 1.ILTV河南長(zhǎng)葛株分離鑒定及其gB，gC和gD基因的克隆與序列分析 雞胚尿囊膜接種和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)分離病毒進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明所分離病毒為ILTV，從而獲得一株ILTV河南長(zhǎng)葛株：并分別克隆其gB、gC和gD基因，測(cè)定其核苷酸序列，將其核苷酸與GenBank公布的ILTV

3、相應(yīng)序列進(jìn)行分析和同源性比較，結(jié)果長(zhǎng)葛分離株ILTV的gB、gC和gD基因3個(gè)序列分別與GenBank登錄的ILTV gB、gC和gD基因序列存在很高的同源性，其同源性在99.7％-99.9％之間，說(shuō)明ILTV的gB、gC和gD基因序列相對(duì)保守。 2.ILTV長(zhǎng)葛株gB、gC和gD基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫效果研究 將ILTV長(zhǎng)葛株gB、gC和gD基因插入pcDNA3.1中，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA-gB、pcD

4、NA-gC和pcDNA-gD。間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，三種重組質(zhì)粒均能夠在PK-15細(xì)胞中表達(dá)。以SPF雞為試驗(yàn)動(dòng)物，肌內(nèi)注射構(gòu)建的pcDNA-gB、pcDNA-gC、pcDNA-gD和pcDNA3.1空載體進(jìn)行免疫接種。微量血清中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA-gB、pcDNA-gC、pcDNA-gD和活疫苗均能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體水平；MTT法檢測(cè)表明構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA-gB、pcDNA-gC、pc

5、DNA-gD及活疫苗對(duì)照均能夠誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖，同時(shí)也能夠誘導(dǎo)強(qiáng)的CTL細(xì)胞的增殖.表明構(gòu)建的載體pcDNA-gB、pcDNA-gC、pcDNA-gD和弱毒疫苗均能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。 3.ILTV長(zhǎng)葛株gD基因的表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立 將ILTV gD基因插入到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28-gD。將pET28-gD轉(zhuǎn)化到宿主表達(dá)菌BL21中，用IPTG

6、誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示表達(dá)目的蛋白大小為55ku，Westem-blotting表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性.表達(dá)的蛋白產(chǎn)物經(jīng)純化后作為ELISA包被抗原，初步建立了間接ELISA診斷方法，并確定了抗原最佳包被濃度為24.5μg·mL；最佳血清稀釋度為1:320，初步確定ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)為OD450≥0.25判為陽(yáng)性，小于0.25為陰性。試驗(yàn)證明建立的間接ELISA具有很強(qiáng)的特異性和較高的敏感性且與多種病毒抗原無(wú)交叉反應(yīng)

7、。用初步建立的ELISA和微量血清中和試驗(yàn)檢測(cè)臨床送檢的84份血清樣品.結(jié)果兩種方法的陽(yáng)性符合率為96.5％(28/29)，陰性符合率為98.2％(55/56)，表明建立的方法可用于臨床上ILT的檢測(cè). 4.表達(dá)ILTV長(zhǎng)葛株gD基因重組禽痘病毒的構(gòu)建及其免疫效力試驗(yàn) 將ILTV長(zhǎng)葛株gD基因同源重組到禽痘病毒基因組中，得到能高效表達(dá)ILTV gD基因的重組禽痘病毒(rFPV-ILTV-gD)。將rFPV-ILTV-gD

8、和ILT弱毒疫苗同時(shí)免疫試驗(yàn)雞，同時(shí)設(shè)非免疫對(duì)照雞群。血清中和抗體檢測(cè)結(jié)果表明：疫苗組與重組病毒組差異不顯著(p>0.05)，而重組病毒組和疫苗組與空白對(duì)照組差異均顯著(p<0.05)。免疫42d攻毒試驗(yàn)表明，重組病毒組和疫苗組對(duì)ILTV強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)率均為96.67％，而空白對(duì)照組為6.67％。說(shuō)明該重組病毒作為弱毒疫苗能夠抵抗ILTV強(qiáng)毒的攻擊，對(duì)免疫雞群有較好的保護(hù)作用。 5.ILTV河南長(zhǎng)葛株gD基因與雞IL-2串聯(lián)重組

9、禽痘病毒的構(gòu)建及免疫效力試驗(yàn) 將ILTV長(zhǎng)葛株的gD基因與雞IL-2串聯(lián)到禽痘病毒表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染后獲得一株重組病毒rFPV-IL2-ILTV-gD，該重組病毒能夠高效表達(dá)ILTV gD基因，將重組病毒rFPV-ILTV-gD、rFPV-IL2-ILTV-gD和ILT弱毒疫苗免疫試驗(yàn)動(dòng)物；同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。免疫后ELISA檢測(cè)結(jié)果表明疫苗組與重組病毒rFPV-IL2-ILTV-gD組、重組病毒rFPV-IL2-ILTV-gD與重組

10、病毒rFPV-ILTV-gD抗體效價(jià)相比差異不顯著(p>0.05)，而重組病毒組rFPV-IL2-ILTV-gD、重組病毒rFPV-ILTV-gD和疫苗組與空白對(duì)照組抗體效價(jià)相比，差異均顯著(p<0.05)。免疫28d攻毒后每組雞的發(fā)病情況表明重組病毒rFPV-IL2-ILTV-gD組、重組病毒rFPV-ILTV-gD和疫苗組對(duì)ILTV強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)率分別為96％、92％和96％，而空白對(duì)照組為8％。說(shuō)明構(gòu)建的重組病毒rFPV-IL2-