表達(dá)綠色熒光蛋白的北美Ⅱ型PRRSV感染性克隆的制備及特性分析.pdf

1、目的：由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染引起的豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，一直是危害養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一，給國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為在分子水平上研究PRRSV與宿主的相互作用及其致病機(jī)制，本試驗構(gòu)建含有綠色熒光蛋白(GFP)基因的PRRSV感染性克隆，并分析了重組PRRSV的某些特性。
　　方法：依據(jù)北美Ⅱ型PRRSV病毒株（GenBank:AY545985.1）的序列，以其感染性克隆重組質(zhì)粒(pFL1

2、2)和含有g(shù)fp基因的質(zhì)粒(pcDNA-EF1-GFP)為模板，采用重疊PCR的方法，擴(kuò)增出上、下游含有PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白2(Nsp2)基因片段的gfp基因，并通過SpeⅠ和XhoⅠ位點將其插入到pFL12的PRRSV Nsp2基因中，并與其融合，構(gòu)建成含gfp基因的PRRSV感染性克隆重組質(zhì)粒pFL12-GFP。重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Acl酶切線性化后，經(jīng)蛋白酶K/SDS處理，酚/酚氯仿抽提和乙醇沉淀，得到純化的線性的pFL12-G

3、FP。利用mMESSAGE mMACHINE體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，在T7 RNA聚合酶的催化下，合成含有5'帽子結(jié)構(gòu)的GFP-PRRSV mRNA。然后利用酵母Poly(A)聚合酶對5'端帽子結(jié)構(gòu)的GFP-PRRSV mRNA進(jìn)行加尾，使其變?yōu)槌墒斓腉FP-PRRSV mRNA，即5'端帶有帽子結(jié)構(gòu)和3'端帶有Poly(A)尾的GFP-PRRSV mRNA。用Transmessenger Transfection試劑將GFP-PRRSV mR

4、NA轉(zhuǎn)染倉鼠腎(BHK-21)細(xì)胞進(jìn)行病毒的包裝，然后用其細(xì)胞裂解液上清感染Marc-145細(xì)胞擴(kuò)增重組病毒，感染48h后，用熒光顯微鏡觀察GFP熒光及PCR方法擴(kuò)增含gfp基因的Nsp2基因片段確定確實拯救出了含gfp基因的重組PRRSV GFP-PRRSV。然后用親本PRRSV和拯救出的GFP-PRRSV感染Marc-145細(xì)胞和豬的肺泡巨噬(PAMs)細(xì)胞，并對其感染性和復(fù)制能力進(jìn)行初步分析。
　　結(jié)果：采用重疊PCR的方法

5、將gfp基因成功地插入到了Nsp2基因的特定位點上，并與其融合，構(gòu)建成含gfp基因的PRRSV感染性克隆重組質(zhì)粒FL12-GFP。然后將PRRSV感染性克隆重組質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄生成GFP-PRRSV mRNA，先后轉(zhuǎn)染BHK-21和感染Marc-145細(xì)胞，成功地拯救出表達(dá)GFP的重組GFP-PRRSV。經(jīng)分析表明，制備的重組GFP-PRRSV與親本PRRSV一樣均能感染Marc-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)，在Marc-14