四種魚卵中卵黃糖蛋白的提取及結(jié)構(gòu)鑒定.pdf

1、魚卵中含有豐富的卵黃蛋白，它們是由卵黃脂磷蛋白(Lv)、卵黃高磷蛋白(Pv)和β'-組分(β'-c)組成，均屬于糖蛋白。近年來對魚類卵黃蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)及其免疫活性研究較多，但對卵黃蛋白上糖鏈的結(jié)構(gòu)研究較少。糖蛋白上的糖鏈承載著許多生物學(xué)信息，對糖鏈結(jié)構(gòu)的分析可以為深入研究該糖蛋白的生物活性和各種其它特性提供理論依據(jù)。本研究以鱘魚、黑魚、鱸魚以及鯽魚魚卵作為實(shí)驗(yàn)材料，采用兩種不同的鹽溶液及提取方法提取四種魚卵中的卵黃蛋白，比較兩種方法

2、的提取率及卵黃蛋白的電泳分布，通過蛋白質(zhì)譜分析，共鑒定出一個(gè)在四種魚卵中均存在的特異性蛋白，并選取黑魚卵中特異性蛋白進(jìn)行部分糖鏈結(jié)構(gòu)解析。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)魚卵中卵黃蛋白提取方法的確定:本研究采用了氯化鈉鹽溶液和Tris緩沖溶液來分別提取四種魚卵中的卵黃蛋白，測定提取液中總蛋白和總糖含量，這兩種溶液的提取率分別為38.1％和25.7％，即氯化鈉鹽溶液的提取率更高。SDS-PAGE電泳分析，四種魚卵中出現(xiàn)明顯不同的蛋白條

3、帶，氯化鈉溶液提取的四種魚卵蛋白條帶清晰，且雜帶較少。其中黑魚和鱸魚卵黃蛋白條帶較純，黑魚中有一條豐度很高、分子量約為26 kDa的蛋白條帶;鱸魚中有兩條分子量分別約為14 kDa、21 kDa的蛋白;鯽魚在兩種溶液中提取，蛋白條帶沒有明顯變化;鱘魚中卵黃蛋白條帶明顯減少。為了便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析，本研究對氯化鈉溶液提取的魚卵蛋白進(jìn)行蛋白鑒定。
　　(2)β'-c特異性蛋白鑒定:選取鱘魚中18 kDa的蛋白、黑魚中26 kDa的蛋白、

4、鱸魚中14kDa的蛋白和鯽魚中16kDa的蛋白進(jìn)行肽指紋質(zhì)量圖譜鑒定。通過LC-MS/MS分析，這四個(gè)蛋白與數(shù)據(jù)庫中魚類卵黃蛋白原序列同源性在90％以上，且與已知β'-c序列的鮭魚(B7XGC3)和食蚊魚(Q589T0)的卵黃蛋白原序列比對，結(jié)果顯示它們均在β'-c區(qū)域上，且部分片段比對成功，即鑒定出這四種蛋白均為β'-c蛋白，且均在卵黃蛋白原的VWFD區(qū)域上，這是第一次在四種魚卵中提取到分子量不同的β'-c蛋白。對鑒定出的四種魚卵β'

5、-c蛋白有效肽段進(jìn)行多序列比對分析，結(jié)果顯示它們之間的序列同源性較低，表明不同魚種中的β'-c蛋白存在差異性。并從數(shù)據(jù)庫中選取9種不同魚種中卵黃蛋白原的VWFD區(qū)域進(jìn)行多序列比對和氨基酸組成分析，結(jié)果顯示不同魚種中的VWFD區(qū)域存在較大的差異性，即進(jìn)一步說明β'-c蛋白存在差異性，這為β'-c蛋白作為特異性標(biāo)記蛋白提供理論依據(jù)。
　　(3)黑魚卵黃糖蛋白結(jié)構(gòu)的鑒定及其促凝血活性評價(jià):采用電泳分離法結(jié)合高效液相色譜法分析黑魚卵黃蛋白

6、的純度，經(jīng)過氯化鈉鹽溶液提取的黑魚卵黃蛋白純度為97％，樣品純度高。PAS特異性染色法確定黑魚卵黃蛋白為糖蛋白。PNGase F酶切法和β-消除法鑒定黑黑魚糖蛋白含有N-糖苷鍵和O-糖苷鍵。為了進(jìn)-步研究糖蛋白的結(jié)構(gòu)，經(jīng)過氣相色譜分析黑魚糖蛋白上的糖鏈單糖組成，結(jié)果顯示為甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.20∶1.00∶12.22。建立分離富集純化及質(zhì)譜鑒定N-糖鏈的方法，鑒定出一個(gè)準(zhǔn)分子離子峰為1580.34 m/z的糖鏈，經(jīng)過二級碎片信息