四種抗結(jié)核藥物與P-糖蛋白相互作用的初步研究.pdf

1、一、目的： 通過(guò)考察四種抗結(jié)核藥物（異煙肼、左氧氟沙星、乙胺丁醇和吡嗪酰胺）對(duì)P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響，以及進(jìn)一步驗(yàn)證利福平對(duì)P-糖蛋白功能和表達(dá)的誘導(dǎo)作用，初步研究四種抗結(jié)核藥物與P-糖蛋白的相互作用。 二、方法： 1、細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)驗(yàn)證 為四種抗結(jié)核藥物對(duì)P-糖蛋白（P-gp）功能和表達(dá)的作用研究提供P-gp載體細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞。 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304）和人結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-

2、2）分別采用1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)；細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞膜上P-gp表達(dá)驗(yàn)證。 2、細(xì)胞毒性試驗(yàn) 采用苯基溴化四氮唑藍(lán)法（MTT）分別考察四種抗結(jié)核藥物、利福平和維拉帕米對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性，以確定其體外最大無(wú)毒濃度（即細(xì)胞存活率大于90％的藥物濃度），保證試驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞的活力。 3、四種抗結(jié)核藥物對(duì)P-糖蛋白功能的影響 采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，以利福平作為P-gp功能誘

3、導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照，維拉帕米作為P-gp功能抑制的陽(yáng)性對(duì)照，分別考察四種抗結(jié)核藥物對(duì)經(jīng)典P-gp功能探針?biāo)幬?-羅丹明-123（Rh-123）攝取作用的影響，從而判斷P-gp功能的變化。 4、從蛋白水平研究四種抗結(jié)核藥物對(duì)P-糖蛋白表達(dá)的影響 以利福平作為P-gp表達(dá)上調(diào)的陽(yáng)性對(duì)照，維拉帕米作為P-gp表達(dá)下調(diào)的陽(yáng)性對(duì)照，不加藥處理的Caco-2細(xì)胞作為陰性對(duì)照，采用流式細(xì)胞術(shù)分別分析四種抗結(jié)核藥物對(duì)Caco-2細(xì)胞上P-gp

4、表達(dá)的影響。 5、從mRNA水平研究四種抗結(jié)核藥物對(duì)MDR1 mRNA表達(dá)的影響 以利福平作為MDR1基因mRNA上調(diào)的陽(yáng)性對(duì)照，維拉帕米作為MDR1基因mRNA下調(diào)的陽(yáng)性對(duì)照，不加藥處理的Caco-2細(xì)胞作為陰性對(duì)照，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別分析四種抗結(jié)核藥物對(duì)Caco-2細(xì)胞MDR1基因mRNA水平表達(dá)的影響。 三、結(jié)果： 1、細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)驗(yàn)證 Caco-2細(xì)胞和ECV304細(xì)胞在

5、正常條件下生長(zhǎng)旺盛；Caco-2細(xì)胞高表達(dá)P-gp，可用于研究四種抗結(jié)核藥物對(duì)P-gp功能和表達(dá)的影響；ECV304細(xì)胞低表達(dá)P-gp，適合作為陰性對(duì)照細(xì)胞。 2、細(xì)胞毒性試驗(yàn) 3d的MTT結(jié)果顯示四種抗結(jié)核藥物、利福平及維拉帕米對(duì)Caco-2細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度分別為： 異煙肼（INH）150μmol/L，左氧氟沙星（LVFX）5μmol/L，乙胺丁醇（EMB）150μmol/L，吡嗪酰胺（PZA）200μmol

6、/L，利福平（RFP）100μmol/L，維拉帕米（VER）10μmol/L。 因此，在后續(xù)的10d、20dMTT實(shí)驗(yàn)中選擇用于長(zhǎng)期含藥培養(yǎng)的四種抗結(jié)核藥物、利福平及維拉帕米的濃度分別為：INH為80μmol/L，LVFX為2μmol/L，EMB為30μmol/L，PZA為100μmol/L（各藥物濃度均接近人常規(guī)劑量給藥后的血藥峰濃度）；RFP為10μmol/L，VER為10μmol/L。最終的MTT結(jié)果顯示：各細(xì)胞存活率均大

7、于90％。因此，選擇的各藥物濃度適用于研究長(zhǎng)期的含藥培養(yǎng)對(duì)P-gp功能和表達(dá)的影響。 3、四種抗結(jié)核藥物對(duì)P-糖蛋白功能的影響 作用1h后，四種抗結(jié)核藥物顯著減少了Rh-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的蓄積（P<0.05），說(shuō)明四種抗結(jié)核藥物均增強(qiáng)了P-gp的外排功能，即對(duì)其功能有誘導(dǎo)作用； 作用3d后，四種抗結(jié)核藥物反而都增加了Rh-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的蓄積（P<0.05），說(shuō)明隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，四種抗結(jié)核

8、藥物又削弱了P-gp的外排功能，即對(duì)其功能有抑制作用； 作用10d后，LVFX仍然是增加了Rh-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的蓄積（P<0.05），為抑制作用；而其他三種抗結(jié)核藥物則都減少了Rh-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的蓄積（P<0.05），轉(zhuǎn)為誘導(dǎo)作用； 作用20d后，LVFX仍為抑制作用（P<0.05）； INH、EMB和PZA仍為誘導(dǎo)作用（P<0.05）。 4、四種抗結(jié)核藥物對(duì)P-糖蛋白表達(dá)的影響

9、 作用1h后，四種抗結(jié)核藥物分別干預(yù)組與陰性對(duì)照組比較，P-gp的表達(dá)量差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明瞬時(shí)（1h）的藥物干預(yù)對(duì)P-gp的表達(dá)量幾乎沒(méi)有影響； 作用3d后，四種抗結(jié)核藥物均下調(diào)了Caco-2細(xì)胞上P-gp的表達(dá)（P<0.05），各組的P-gp表達(dá)量?jī)H為陰性對(duì)照組的40％左右； 作用10d后，INH、EMB和PZA均上調(diào)了Caco-2細(xì)胞上P-gp的表達(dá)（P<0.05），其中INH、EMB的P-gp表達(dá)量約為陰性對(duì)

10、照組的4～7倍，PZA約為陰性對(duì)照組的1.4倍；而LVFX則下調(diào)了Caco-2細(xì)胞上P-gp的表達(dá)（P<0.05），其P-gp表達(dá)量約為陰性對(duì)照組的50％； 作用20d后，INH、EMB、PZA均上調(diào)了Caco-2細(xì)胞上P-gp的表達(dá)（P<0.05），其中INH、EMB的P-gp表達(dá)量約為陰性對(duì)照組的4倍，PZA約為陰性對(duì)照組的1.2倍；而LVFX則下調(diào)了Caco-2細(xì)胞上P-gp的表達(dá)（P<0.05），其P-gp表達(dá)量約為陰性

11、對(duì)照組的50％。 5、四種抗結(jié)核藥物對(duì)MDR1 mRNA表達(dá)的影響 作用1h后，四種抗結(jié)核藥物干預(yù)組與陰性對(duì)照組比較，MDR1 mRNA的表達(dá)量差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明瞬時(shí)（1h）的藥物干預(yù)對(duì)MDR1 mRNA的表達(dá)量也幾乎沒(méi)有影響； 作用3d后，四種抗結(jié)核藥物均下調(diào)了Caco-2細(xì)胞上MDR1mRNA的表達(dá)（P<0.05），各組的MDR1 mRNA表達(dá)量?jī)H為陰性對(duì)照組的30％左右； 作用10d后，INH

12、、EMB和PZA均上調(diào)了Caco-2細(xì)胞上P-gp的表達(dá)（P<0.05），其中INH、EMB的MDR1 mRNA的表達(dá)量為陰性對(duì)照組的12倍，PZA約為陰性對(duì)照組的1.3倍；而LVFX則下調(diào)了Caco-2細(xì)胞上MDR1 mRNA的表達(dá)（P<0.05），其MDR1 mRNA表達(dá)量約為陰性對(duì)照組的30％； 作用20d后，INH、EMB和PZA均上調(diào)了Caco-2細(xì)胞上P-gp的表達(dá)（P<0.05），其中INH、EMB的MDR1 mR