木聚糖酶測定的有關(guān)問題

1、飼料用木聚糖酶活力測定的研究飼料用木聚糖酶活力測定的研究文章來源：農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心作者：陸文清等更新時(shí)間：20110330飼料用木聚糖酶的分析測定是長期以來困擾木聚糖酶生產(chǎn)和應(yīng)用的一個(gè)主要難題特別是固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的木聚糖酶發(fā)酵成品中往往含有其它非淀粉多糖酶(纖維素酶、葡聚糖酶、果膠酶和甘露聚糖酶等)[13]。文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于影響酶活測定的因素很多測定的重復(fù)性較差[45，7]，除了溫度和pH值以外還存在著其它很多不確定的因素。本文將從底物的

2、性質(zhì)和濃度、酶樣的稀釋度、離子強(qiáng)度和反應(yīng)時(shí)間等方面討論對酶活測定的影響提出比較可行的飼料用木聚糖酶的分析方法。酶活定義為在37℃和設(shè)定pH值條件下，每分鐘內(nèi)從底物溶液中降解釋放1μmoll還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活單位(U)。測定木聚糖酶活力的方法主要有3種：粘度法、底物染色法和還原糖法。粘度法是通過測定木聚糖酶對底物粘度的降解速度來計(jì)算酶活力，這種測定分析方法有較好的實(shí)用價(jià)值，但是測定過程比較繁瑣，而且重復(fù)性較差，目前很少采用。底物

3、染色法是一種比較簡便快速的測定方法其基本原理是以木聚糖為基質(zhì)用膠聯(lián)方式連接和包裹特定的染料，制成染料含量均衡質(zhì)量穩(wěn)定的片劑。這種片劑容易溶于水溶液中與木聚糖酶反應(yīng)后長鏈的木聚糖被降解結(jié)合的染料分子被釋放到溶液中。通過測定溶液中染料的濃度就可以就算出酶活力。這種測定方法經(jīng)常被一些專業(yè)生產(chǎn)生物酶的大型企業(yè)采用。但是它只能測定特定的木聚糖酶活力不具有代表性。還原糖法是通過測定還原糖的產(chǎn)量來計(jì)算酶活力。這種分析方法也比較簡便，而且重復(fù)性也比較好

4、。國內(nèi)外關(guān)于木聚糖酶的研究報(bào)告多數(shù)采用這種方法。這種方法的主要不足是不能很好地分析內(nèi)切酶的活力，而內(nèi)切酶的活力對于飼料酶的實(shí)際使用效果來說是很重要的。如果希望通過測定木聚糖酶在某一標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的活力來判斷木聚糖酶質(zhì)量的優(yōu)劣或者預(yù)測其動(dòng)物飼喂效果是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。木聚糖酶的實(shí)際作用底物是不溶于水的高聚物，它們主要存在于植物種子的表皮層內(nèi)，與葡聚糖、果膠、甘露聚糖、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合在一起。在天然木聚糖與水組成的多相體系中，酶總是處于

5、底物不飽和狀態(tài)，因此難以用測定酶反應(yīng)初速度的方法測定酶活力。酶與底物的反應(yīng)是在固相界面上進(jìn)行的，其酶解反應(yīng)速率受到底物對酶蛋白吸附速率和產(chǎn)物擴(kuò)散速率的限制[4]。目前通常采用的底物是溶于水的木聚糖，如燕麥木聚糖和樺木木聚糖，其測定值要比實(shí)際發(fā)揮作用的酶活力高出很多倍[56]。從目前的研究進(jìn)展分析，制定一個(gè)絕對公平的標(biāo)準(zhǔn)是很困難的，幾乎是不可能的。必要的。由圖2可知，三種木聚糖酶(Xylanase1、Xylanase2、Xylanase3

6、分別來源于硫色曲霉A.sulphureus、米曲霉A.zyae和黑曲霉A.niger)，它們的飽和底物濃度都不超過3.0mgml。目前市場上流行的由畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)生的木聚糖酶，其結(jié)構(gòu)基因也是來自曲霉菌或者細(xì)菌，而細(xì)菌產(chǎn)生的木聚糖酶(包括其它酶種)其飽和底物濃度遠(yuǎn)低于曲霉菌產(chǎn)生的酶。燕麥木聚糖(SigmaX0627X0627)在中性條件下很難溶解，在堿性條件下容易溶解。在溶解燕麥木聚糖底物時(shí)可以先在氫氧化鈉堿性溶液中溶解，然后再用醋酸溶液

7、調(diào)節(jié)到所需的酸堿度。事實(shí)證明，這種方式是比較好的，所產(chǎn)生的本底還原糖濃度也是很低的，對測定結(jié)果影響很小。1.4反應(yīng)液離子強(qiáng)度對測定的影響反應(yīng)液的離子強(qiáng)度對酶活力測定結(jié)果也有影響。如圖3所示：在不同離子強(qiáng)度條件下測定纖維素酶的活力，結(jié)果有較大差異。溶液的離子強(qiáng)度影響酶分子的空間構(gòu)像，從而影響了酶分子活力的發(fā)揮。所以，在測定過程中應(yīng)該統(tǒng)一反應(yīng)液的離子強(qiáng)度，這一點(diǎn)往往被人們忽視。那么究竟應(yīng)該選擇何種離子強(qiáng)度比較合適，目前還沒有統(tǒng)一。不同的酶系

8、要求的最佳離子強(qiáng)度各不相同，需要經(jīng)過探索才能確定。根據(jù)畜禽消化道的生理狀況，筆者建議反應(yīng)液的離子強(qiáng)度采用0.1moll。1.5反應(yīng)時(shí)間的選擇為了使獲得的測定值盡可能準(zhǔn)確，不僅需要選擇在線性的反應(yīng)范圍內(nèi)，而且應(yīng)該有足夠的線性反應(yīng)時(shí)間。在線性反應(yīng)條件下，延續(xù)的作用時(shí)間越長，測定的相對誤差也越小。大量研究發(fā)現(xiàn)不同的酶系其線性作用時(shí)間各不相同。一般情況下酶系較全的組分線性作用時(shí)間較長。而酶系比較簡單的組分線性作用時(shí)間較短。圖4是2種比較典型的木

9、聚糖酶系及比利時(shí)生產(chǎn)酶C的線性范圍。硫色曲霉(A.sulphureusMAFIC001)產(chǎn)生的木聚糖酶A的線性作用時(shí)間接近100min，黑曲霉(A.nigerMAFIC005)產(chǎn)生的木聚糖酶B的線性作用時(shí)間不到60min。從文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)和筆者的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，比利時(shí)生產(chǎn)的一種由細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的木聚糖酶C的線性作用時(shí)間最長，可達(dá)8h左右。線性反應(yīng)時(shí)[NextPage]間最短的商業(yè)木聚糖酶是由一種木霉發(fā)酵產(chǎn)生的，線性反應(yīng)時(shí)間不到20min[5