山羊瘤胃宏基因組中葡聚糖酶-木聚糖酶的篩選與性質(zhì)分析.pdf

1、為了獲取木質(zhì)纖維素多糖降解酶基因，本文以Fosmid為載體構(gòu)建了約含9500個克隆的山羊瘤胃微生物宏基因組文庫。該文庫的陽性率為100％，插入片段均值大于30 kb，包含了至少285 Mb的宏基因組信息。通過剛果紅染色法篩選獲得了EcoRI酶切圖譜不同的6個葡聚糖酶陽性克隆和4個木聚糖酶陽性克隆。
　　 初步分析了陽性克隆的末端序列、酶譜和粗酶的酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)葡聚糖酶陽性克隆10的GRFosCEL-10末端序列與己知序列的一致度

2、最低(identity 57％)，推測其插入序列新穎性較高，葡聚糖酶陽性克隆2、3、9、13的粗酶在pH4.0時呈現(xiàn)出最高活性，推測其中可能含有耐酸性葡聚糖酶。4個木聚糖酶陽性克隆Fosmid的末端序列與已知序列相似度均較低(identity 26-51％)，說明其插入序列的新穎性較高，另外，4個克隆粗酶的最適pH和溫度一致，均為7.0和50℃。
　　 選取葡聚糖酶陽性克隆10的GRFosCEL-10進行全序列測定，從中分析得到

3、了4個糖苷水解酶編碼基因，orf11、12、16和18。BlastP比對分析4個基因的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)ORF11(命名為CelA)與源于Roseburia intestinalis L1-82的內(nèi)切葡聚糖酶具有最高相似性，一致度為55％; ORF12與Prevotella ruminicola 23來源的GHF43糖苷水解酶具有最高相似性，一致度為36％;ORF16與Ruminococcaceae bacterium來源的β-葡糖苷酶具有

4、最高相似性，一致度為39％;ORF18與Bryantella formatexigens DSM14469來源的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶具有最高相似性，一致度為64％。
　　 選取celA基因進行后續(xù)分析，該基因長1，449 bp，預(yù)測編碼蛋白大小為53.2kDa。其編碼蛋白由N端～90個氨基酸大小的未知功能序列和C端的糖苷水解酶第5家族催化結(jié)構(gòu)域組成。序列比對發(fā)現(xiàn)其催化結(jié)構(gòu)域活性中心為Glu280和Glu412。37℃異源表達4

5、h后得到了截短表達的大小為45kDa的蛋白，N端測序結(jié)果表明該截短蛋白起始于全長蛋白的第112個氨基酸。將CelA的截短蛋白進行了純化及后續(xù)的功能分析，發(fā)現(xiàn)其最適pH為7.0，最適溫度為50℃，在pH4.0-10.0中放置24 h可保留大于60％的活性，具有較廣的pH耐受性。并且，金屬離子中10 mM Mg2+、Ca2+和Mn2+可顯著促進酶活性至211％、228％和264％，1mM Cr3+和化學(xué)試劑EDTA同樣具有較明顯的促進作用。

6、該酶具有很強的鹽離子耐受性，0-3.5 M NaCl和KCl均對該酶活性起到促進作用，并且1M NaCl和KCl可分別將其活性提高至3倍和2倍。另外，CelA具有較廣的底物降解能力，可以降解多種β-1，4鍵連接的底物，并對β-1，3/4鍵連接的地衣多糖和大麥葡聚糖顯現(xiàn)出最高活性。綜上而言，CelA的活性可被幾種常見的金屬離子和化學(xué)試劑顯著促進，并且其具有很強的鹽離子耐受性和較廣的底物降解能力，表明其具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。
　　

7、 選取木聚糖酶陽性克隆10中GRFosXYL-10進行全序列測定，分析得到了一條木聚糖酶基因xyn10A。序列比對發(fā)現(xiàn)在已知功能的蛋白中，其與來源于Fibrobacter succinogenes subsp.succinogenes S85的family 10 glycosyl hydrolase XynB(accession number: AAG36763)具有最高相似性，一致度達47％。該基因全長2709bp，編碼902個氨基酸

8、，理論分子量為98.6 kDa，理論等電點為5.36。結(jié)構(gòu)域分析表明其包含一個N端的GHF10催化結(jié)構(gòu)域和C端兩個連續(xù)的CBM6碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分別命名為CBM6-1和CBM6-2，兩者的一致度為53％。該模塊結(jié)構(gòu)在糖苷水解酶第10家族木聚糖酶中屬于一種新型的模塊結(jié)構(gòu)。為了研究Xyn10A的功能，我們異源表達并純化了截掉信號肽的Xyn10A-TX1以及進而截掉C端兩個CBM6結(jié)構(gòu)域的Xyn10A-TX2，并進行了后續(xù)的性質(zhì)分析。X

9、yn10A-TX1的最適pH為7.0，最適溫度為45℃，其不耐受高溫，但對堿性環(huán)境具有一定耐受性。多數(shù)金屬離子對其顯示抑制作用，但1mM的重金屬離子pb2+、Co2+、Cr3+對酶活性有較明顯促進作用?；瘜W(xué)試劑EDTA、Tween20、DTT同樣對酶活性具有顯著促進。另外，Xyn10A-TX1對不可溶燕麥木聚糖具有較高降解活性和結(jié)合能力，且可以結(jié)合不可溶底物Avicel。截掉兩個CBM6后，Xyn10A-TX2的最適pH變?yōu)?.5，最適