阮長耿血小板的研究進展

1、血小板的研究進展,蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 江蘇省血液研究所阮長耿,一、血小板黏附、活化在血栓形成中的重要性,在生理性止血及動脈血栓形成過程中，血小板粘附到暴露的血管內(nèi)皮下基質(zhì)并發(fā)生血小板活化是血栓形成的起始階段，進而產(chǎn)生血小板聚集和釋放反應(yīng)，最終導(dǎo)致血小板血栓形成?，F(xiàn)狀：參與黏附的相關(guān)分子的結(jié)構(gòu)、信號傳導(dǎo)以及這些分子 缺陷所引起的臨床疾病和癥狀； 進展：vWF-A1/GPIb?, vWF-A2/ADAMTS1

2、3, vWF-A3-膠原抗血栓藥物：抗GPIb/IX/V－vWF－膠原軸； 抗GPⅥ/α2β1－膠原軸制劑；,,,,,,Exposed collagen,platelet,血小板膠原受體,,高剪切力條件下血小板初期不穩(wěn)定粘附依賴GPIb/IX/V復(fù)合物和GPⅥ的協(xié)同作用黏附后的血小板活化由GPⅥ介導(dǎo)血小板牢固粘附則依賴GPIa/IIa和GPIIb/IIIa的共同作用活化的血小板

3、釋放ADP、 TXA2，進一步加強 血小板粘附和聚集,血小板的黏附過程,Primary Platelet Adhesion Receptors,有關(guān)血小板膠原受體在血小板黏附及活化過程中的相對作用一直存在爭議。最近發(fā)現(xiàn)GPIb/IX/V與GPⅥ可發(fā)生免疫共沉淀，結(jié)合兩者有相似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，故有人提出GPIb/IX/V與GPⅥ在血小板膜

4、上相互彼鄰，在功能上相互協(xié)同。,,GPVI缺乏患者的血小板聚集和釋放反應(yīng)圖,Moroi M等1989年報導(dǎo)一名GPVI缺乏患者有出血傾向，而膠原（2ug/ml)誘導(dǎo)的血小板聚集為3%（正常對照：50-75%）ATP不釋放。ADP和瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集和釋放正常。,Moroi M, et al . J Clin Invest, 1989;84:1440,Aggregation of platelets from ?2 deficie

5、nt mice in response to soluble collagen. Integrin 2-deficient mice develop normally, are fertile, and display no obvious anatomical defects—Homozygous 2-deficient mice are viable and show no striking phenotypical differe

6、ncewhen compared with their heterozygous and wild type littermates.,Holtkotter O,et al.J Biol Chem, 2002:277:10789,抗血小板藥物,,,藥物 作用環(huán)節(jié),第一代 阿司匹林 環(huán)氧酶抑制劑 臨床應(yīng)用

7、 Ticlopidine ADP活化抑制劑 臨床應(yīng)用第二代 Reopro GPIIb-IIIa受體抑制劑 臨床應(yīng)用第三代 JAQ1 GPVI（膠原）受體抑制劑 動物實驗 AjvW2, 6B4

8、 “vWF-GPIb”抑制劑 動物實驗 82D6A3 “vWF-膠原” 抑制劑 動物實驗,,抗GPⅥ/α2β1－膠原軸制劑,抗GPIa/IIa抗體：15D7和6F1體外實驗表面可抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集；抑制高剪切力條件下血小板與固定的纖維狀膠原表面的黏附抗GPⅥ單克隆抗體： JAQ1 9O12、6B12、11A12、

9、SZ118等體外實驗中，JAQ1完全抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，對凝血酶和佛波酯誘導(dǎo)的聚集無影響。體內(nèi)實驗中，JAQ1抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集和促凝活性表達。 肺栓塞模型中，95%對照小鼠在栓塞誘發(fā)后5分鐘內(nèi)死亡，而經(jīng)JAQ1處理小鼠均存活。使用JAQ1后出血的副作用輕。,,血小板與膠原表面的有效黏附是血栓形成的必備條件之一，因而GPIb/IX/V-vWF-膠原軸和GPⅥ/α2β1-膠原軸為抗血小板粘附治療的主要靶點。,抗黏附

10、治療作用策略：,15D7,11A12,SZ118,,抗GPIb/IX/V－vWF－膠原軸,抗GPIb單克隆抗體: 6B4 (SZ2)在狒狒的Folts模型中，6B4 Fab片斷2 mg·kg－1注射。GPIb封閉率 69%；股動脈CFR抑制率100%；瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率100%；血小板數(shù)、出血時間無明顯變化，PT、APTT正常。,Folts 模型,Reopro對CFRs發(fā)生的影響,,2.5ug/ml Reop

11、ro,,0.0 3.0 6.0 0.0 2.5,,,813-F(ab)2,Reopro,,0.0 3.0 6.0 0.0 2.5,813-F(ab)2 Reopro,*,*,*,*,0.01<P<0.05

12、,*,抗vWF A1區(qū)單抗AJW200 在狗冠狀動脈Folts’實驗?zāi)Ｐ椭?，AJW200 0.3mg·kg－1，冠狀動脈內(nèi)血栓形成抑制率達96％，體外血小板聚集抑制率81%；血小板數(shù)無明顯變化，但出血時間有延長（5～22分）。,Bar graph showing inhibitory effect of AJvW-2 on neointima formation 14 days after balloon injur

13、y. AJvW-2 was administered as a single bolus injection at doses of 0.6 mg/kg (n=11) and 1.8 mg/kg (n=10). *P<0.01 vs control (n=11).,Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000;20:2303-2308.,AJvW-2 抗血管內(nèi)膜增殖效應(yīng),活化血小板可釋放出多種活性物質(zhì)如PD

14、GF、PAF、CD40L、MIP-1α和P選擇素等，介導(dǎo)血管損傷部為的炎性反應(yīng)，出現(xiàn)炎性細胞遷移、平滑肌細胞和成纖維細胞的增殖，促進動脈粥樣斑塊的發(fā)展。 抗vWF A1區(qū)單抗AJvW-2 可使受損的豚鼠頸動脈血管內(nèi)膜/中層比下降65%，對血小板數(shù)、出血時間、PT、APTT無影響。 以上結(jié)果表明抑制血小板粘附可減少血小板活化及血小板來源的細胞因子釋放，減輕炎性反應(yīng)和細胞增殖，有助于延緩動脈內(nèi)膜病變。,抗vWF A1區(qū)單

15、抗AJW200 AJW200人體實驗（24例），AJW200 0.05 mg·kg－1，血漿vWF封閉率為62.4％；vWF：Rcof活性為34％±16％（對照116％±41％）；PFA-100血流停止時間為202±78秒（對照 80±19秒）；所有志愿者出血時間和vWF抗原水平均無顯著變化。,抗GPIb/IX/V－vWF－膠原軸,抗GPIb單克隆抗體: 6B4

16、在狒狒的Folts模型中，6B4 Fab片斷2 mg·kg－1注射。GPIb封閉率 69%；股動脈CFR抑制率100%；瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率100%；血小板數(shù)、出血時間無明顯變化，PT、APTT正常。VWF A3區(qū)單克隆抗體 82D6A3： 在狒狒動脈血栓形成實驗中，82D6A3 0.3 mg·kg－1可完全抑制股動脈血管內(nèi)血栓形成， vWF與膠原結(jié)合能力抑制96％；實驗動物的血小板

17、數(shù)、凝血指標、VWF水平和出血時間均無明顯改變。,抗血小板粘附藥物的優(yōu)點,在動脈內(nèi)高剪切力條件下，血小板有效粘附和血栓形成必需依賴膠原-vWF-GPIb軸，對此途徑的抑制可更為特異地防止動脈內(nèi)的血栓形成，而對靜脈系統(tǒng)的影響小，出血副作用輕。血小板粘附后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和血小板活化則主要依賴膠原-GPVI軸，對此途徑的抑制即可在更早階段阻止血小板活化，進而抑制血栓形成。在較早階段抑制了血小板與病變部位的粘附及血小板活化，可明顯減少血小板釋放

18、CD40, PDGF等細胞因子，能顯著減輕血管炎性反應(yīng)和細胞增殖，有助于延緩動脈內(nèi)膜病變，減少再梗死的發(fā)生。,二、血栓性血小板減少性紫癜(TTP),五聯(lián)征：發(fā)熱、血小板減少性紫癜、微血管性溶血性貧血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、腎臟受累發(fā)病機制：vWF-cp質(zhì)或量異常(vWF-cp基因變異、抗 vWF-cp自身抗體)血管內(nèi)皮損傷（抗內(nèi)皮細胞自身抗體、細胞毒素）血小板活化凝血酶敏感蛋白1,ADAMTS-13 缺乏相關(guān)性TTP

19、發(fā)病機制模式圖,,Tsp1 repeat,vWF-cp結(jié)構(gòu)模式圖,vWF-cp結(jié)構(gòu)圖及基因突變位點：,,* 我所發(fā)現(xiàn)的新突變位點,*,臨床表現(xiàn)： 見于任何年齡，大多數(shù)在15—50歲；女性多見。 ?出血：以皮膚粘膜出血為主，嚴重者可發(fā)生顱內(nèi)出血。 ?微血管病性溶血性貧血：黃疸，血紅蛋白尿。 ?神經(jīng)精神癥狀：意識紊亂、頭痛、失語、驚厥、視力障礙、譫妄及偏癱等；以一過性，反復(fù)性和多變性為特征。

20、 ?腎臟損害：蛋白尿、血尿、肌酐升高，腎功能衰竭。 ?發(fā)熱：熱型不一，體溫常達38℃～40.5℃。,,血常規(guī)、血管內(nèi)溶血相關(guān)檢查 vWF多聚體分析 vWF-cp活性測定 vWF-cp抗原測定 vWF-cp自身抗體測定 vWF-cp基因突變檢查 ADAMTS-13/FXI Complex ELISA,實驗室檢查,vWF多聚體分析,SDS-PAGE加免疫印跡（Furlan方法）雙向免疫輻射計（Obe

21、rt方法）殘余膠原結(jié)合試驗（Gerristsen方法）殘余瑞斯脫霉素輔因子活性試驗(Bohm方法）特異性微小重組底物（GST-VWF73-H）用于vWF-cp活性檢測,vWF-cp活性測定,ADAMTS13 抗原測定（ELISA）,ADAMTS13 自身抗體測定（ ELISA）,治療： 診斷明確或高度懷疑本病時應(yīng)盡早開始治療。 1，血漿置換及輸注新鮮血漿 仍是目前最有效方法，60％－90％病例有效，血

22、漿置換量每天2－3升（20ml—30ml/Kg），嚴重者可增加至40ml—80ml/Kg。病情穩(wěn)定后繼續(xù)1－2周。 2，免疫抑制劑 長春新堿每周1－2mg×4－6周； 或潑尼松1mg/kg，酌情增減。 3，抗血小板GPIIb/IIIa單抗可阻斷血小板聚集， 4，抗CD20抗體、免疫球蛋白、切脾對難治、復(fù)發(fā) 或存在自身抗體的TTP有效。,三、血小板血栓形成

23、調(diào)控因素,黏附、活化后的血小板從血流中募集/聚集血小板，形成穩(wěn)定的血小板血栓。 除已知的調(diào)控因素外，目前發(fā)現(xiàn)有多種新的調(diào)控途徑參與血小板血栓的穩(wěn)定過程。,,Brass L. ATVB 2004;24:989-991,Gas6的結(jié)構(gòu)及作用,Gas6 ( growth arrest-specific 6 )是一種維生素K依賴蛋白，結(jié)構(gòu)類似蛋白S，分子量75kDa，存在于靜息血小板的α顆粒中。血小板活化后，Gas6被釋放至血小板

24、表面和液相介質(zhì)中。 體內(nèi)和體外實驗均證明Gas6具有促進血小板活化作用，Gas6基因剔除或抗體抑制均可抑制血小板聚集及血栓形成。 Gas6受體為血小板膜表面蛋白Mer（Ax1,Tyro3)，兩者結(jié)合后，通過蛋白磷酸化途徑（涉及PI-3K）活化血小板。根據(jù)Gas6-Mer作用特點，其功能發(fā)揮主要在血栓形成后期，對血栓形成有促進和穩(wěn)定作用。,Gas6受體knockout對血小板聚集功能的影響,Gas6受體

25、knockout對血小板伸展功能的影響,,,Gas6受體knockout對血栓形成功能的影響,TOPICS1. Blood Coagulation Mechanisms2. Platelet Physiology and Immunology3. Bleeding Disorders4. Venous Thromboembolism (Management of DVT, DVT in Asia and Wes

26、tern Countries)5. Atherothrombosis in Asia: Aspects Different from Western World6. Update on Anti-Platelet Therapy7. New Developments on Antithrombotic Drugs8. Chinese Herbal Medicine in Anti-Thrombotic T