cck-8操作說(shuō)明與檢測(cè)步驟

1、DOJINDO操作說(shuō)明細(xì)胞活性檢測(cè)1.在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100ml孔)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)(在37℃，5%CO2的條件下)。2.向每孔加入10ml的CCK8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響O.D值的讀數(shù))。3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育14小時(shí)。4.用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。5.如果暫時(shí)不測(cè)定O.D值，打算以后測(cè)定的話，可以向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液或者1%wvSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室

2、溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)1.在96孔板中配制100ml的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)(在37℃，5%CO2的條件下)。2.向培養(yǎng)板加入10ml不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如:61224或48小時(shí))。4.向每孔加入10mlCCK8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響O.D值的讀數(shù))。5.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育14小時(shí)。6.用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度

3、。7.如果暫時(shí)不測(cè)定O.D值，打算以后測(cè)定的話，可以向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液或者1%wvSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。注意：如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1.先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。2.按比

4、例(例如：12比例)依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做35個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組36個(gè)復(fù)孔。3.接種后培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加CCK8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定O.D值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)(X軸)，O.D值為縱坐標(biāo)(Y軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量(使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK8后的培養(yǎng)時(shí)間)。將CCK8溶液稀釋1倍，然后加入培養(yǎng)基體

5、積20%的量。3.能否用24孔板進(jìn)行試驗(yàn)？可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK8溶液。4.酚紅會(huì)影響檢測(cè)嗎？不會(huì)。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。5.CCK8與胸苷結(jié)合檢測(cè)之間是否有相關(guān)性？有。然而，請(qǐng)注意由于CCK8使用的檢測(cè)原理與胸苷檢測(cè)的不同，因此結(jié)果可能不同。6.CCK8能否檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞？可以檢測(cè)E.coli，但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。向100μlE.coli培養(yǎng)液中

6、加入10μlCCK8溶液，并培養(yǎng)14個(gè)小時(shí)或過(guò)夜。7.CCK8穩(wěn)定嗎？CCK8在05℃下能夠保存至少6個(gè)月，在20℃下避光可以保存1年。如果需要長(zhǎng)期保存，我們推薦20℃的儲(chǔ)藏條件。8.如果沒(méi)有450nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？還可使用450nm到490nm之間的濾光片。9.如何減少由于CCK8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來(lái)的誤差？可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK8試劑并混勻后加樣。10.CCK8是什么顏色？應(yīng)該是粉紅色。若顏