臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室工作規(guī)范

1、1為使基因擴(kuò)增檢驗技術(shù)有效地應(yīng)用于臨床，更好地為疾病的預(yù)防、診斷和治療服務(wù)，保證檢驗質(zhì)量，特制定本規(guī)范。一、臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置及其管理一、臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置及其管理臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置詳見《臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理暫行辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號文)附件《臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》。為避免污染，必須嚴(yán)格遵循《臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室。臨床基因

2、擴(kuò)增檢驗實驗室四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。進(jìn)入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)(簡稱擴(kuò)增區(qū))至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別。此外，當(dāng)工作者離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)

3、特定的工作服帶出。清潔方法不當(dāng)也是污染發(fā)生的一個主要原因，因此實驗室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實驗區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。(一)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)下述操作在該區(qū)進(jìn)行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。貯存試劑和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)

4、，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當(dāng)貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，避免由于?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴(kuò)增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為避免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實驗室內(nèi)一次測定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)來決定。主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過預(yù)試驗來檢查，評價結(jié)果必須有書面報告。對于“

5、熱啟動“技術(shù)(在第一個高溫變性步驟后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。在整個本區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。本工作區(qū)的實驗臺表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動

6、紫外燈(254nm波長)，在工作完成后調(diào)至實驗臺上60~90cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。實驗室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。(二)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)下述操作在該區(qū)進(jìn)行：臨床標(biāo)本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走

7、動?？赏ㄟ^在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，3由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實驗人員的安全防護(hù)。本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負(fù)壓條件或減壓情況下(如安裝排風(fēng)扇)可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。二、臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室質(zhì)量保證二、臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室質(zhì)量保證臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室質(zhì)量保證涉及到整個

8、基因擴(kuò)增檢驗的所有階段，即測定分析前的標(biāo)本采集處理、測定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報告等。(一)標(biāo)本的采集標(biāo)本的采集常用于基因擴(kuò)增檢測的臨床標(biāo)本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。當(dāng)使用非密閉采樣系統(tǒng)時，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，因為

9、玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因為肝素是Taq酶的強(qiáng)抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。臨床用于RNA(如HCVRNA)擴(kuò)增檢測的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快(3小時以內(nèi))分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時內(nèi)分離血清。(二)標(biāo)本的穩(wěn)定化處理標(biāo)本的穩(wěn)

10、定化處理用于DNA擴(kuò)增檢測的標(biāo)本，采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時送至實驗室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測定的標(biāo)本有時必須進(jìn)行穩(wěn)定化處理，如流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)場采樣。異硫氰酸胍鹽(GuanidinethiocyanateGITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標(biāo)本時，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5molLGITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經(jīng)上述穩(wěn)定化處理

11、后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄PCR測定方法來評價。(三)標(biāo)本的運(yùn)送標(biāo)本的運(yùn)送標(biāo)本采集后必須盡快送至實驗室。經(jīng)過適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過郵寄運(yùn)送。如用于DNA擴(kuò)增檢測的EDTA抗凝全血標(biāo)本及用于RNA擴(kuò)增檢測的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。通常在運(yùn)送時，應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。用于RNA檢測的標(biāo)本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。(