高原肺水腫易感基因關(guān)聯(lián)分析及其功能研究.pdf

1、本研究以青藏鐵路建設(shè)為背景，采用候選基因關(guān)聯(lián)分析方法，研究HAPE遺傳易感性的分子機(jī)制，旨在從分子水平揭示HAPE的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，闡釋遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的病因?qū)W機(jī)制，為高危人群風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)方法，以減少發(fā)病率，提高治療率。 第一部分、高原肺水腫候選基因的關(guān)聯(lián)研究。 目的：本文以青藏鐵路筑路工人為研究對象，對284例樣本進(jìn)行病例—對照關(guān)聯(lián)分析，高原肺水腫(HAPE)組140例，正常對照(healthy c

2、ontrol，HC)組144例。對9個(gè)HAPE候選目標(biāo)基因的18個(gè)SNP進(jìn)行分型。采用多位點(diǎn)的單倍型預(yù)測和交互效應(yīng)分析方法，檢測與HAPE相關(guān)的SNP特異單倍型組合，并探索可能存在的基因—基因間的相互作用。本文首次引入多元簡約法(MDR)，可大大提高結(jié)果分析的力度和可信性。 方法： 1)樣本選擇：根據(jù)HAPE的診斷標(biāo)準(zhǔn)，從青藏鐵路筑路工人中選取140例HAPE患者和144例嚴(yán)格匹配的HC個(gè)體。 2)SNP分型：P

3、CR—RFLP，PCR—SSCP結(jié)合PCR測序技術(shù)鑒定SNP的基因型。 結(jié)果： 單個(gè)位點(diǎn)分析： 1)腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAAS)中，單位點(diǎn)分析結(jié)果顯示：醛固酮合成酶基因(CYP11B2)C—344T，K173R位點(diǎn)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因(ACE)A—240T位點(diǎn)與HAPE易感顯著相關(guān)(P<0.0050)。 2)肺泡上皮鈉通道蛋白α亞基(αENaC)基因(SCNN1A)：A663T位點(diǎn)的等位基因

4、頻率在兩組間的分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0227)。 3)熱休克蛋白70家族基因(HSP70)：熱休克蛋白70-1基因(HSPA1A)A—110C多態(tài)位點(diǎn)的基因型(P=0.0314)及等位基因(P=0.0247)頻率在兩組間的分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 連鎖分析： 對RAAS系統(tǒng)5個(gè)基因中的10個(gè)SNP進(jìn)行連鎖分析。在兩組中，CYP11B2C—344T和K173R兩位點(diǎn)間連鎖不平衡(linkage disequili

5、brium，LD)程度很強(qiáng)(HAPE組D’=0.94和HC組D’=0.97)。對HSP70家族中3個(gè)基因的5個(gè)SNP進(jìn)行連鎖分析，在兩組中熱休克蛋白70-2基因(HSPA1B)G2074C及熱休克蛋白70-hom(HSPA1L)T2437C兩位點(diǎn)完全連鎖(HAPE組D’=1.00和HC組D'=1.00)，在HC組中T2437C分別與HSPA1BA1267G或HSPA1AG190C兩位點(diǎn)間完全連鎖(D，=1.00)，而在HAPE組中A12

6、67G與G190C兩位點(diǎn)間存在中度連鎖(D’=0.61)。 基因—基因間交互效應(yīng)分析及單倍型預(yù)測： 1)應(yīng)用MDR軟件，在RAAS系統(tǒng)基因中選擇了5個(gè)SNP，包括血管緊張素原基因(AGT)M235T；ACEA—240T，A2350G；緩激肽B2受體基因(BKB2R)C—58T和CYP11B2 C—344T位點(diǎn)。 2)SCNN1A基因中3個(gè)SNP進(jìn)行單倍型分析，經(jīng)Bonferrou校正(P<0.0167，0.05/

7、3)，發(fā)現(xiàn)在HAPE組中單倍型H2(C—C—A，等位基因按照C+7T，T334A和A663T順序組合單倍型)的頻率顯著低于HC組(25.5％vs．36.0％，P=0.0067)。MDR交互效應(yīng)分析結(jié)果顯示，3個(gè)SNP存在較弱的交互效應(yīng)。 3)HSP70基因中5個(gè)SNP進(jìn)行交互效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，A—110C和A1267G存在強(qiáng)交互效應(yīng)，同時(shí)與G190C存在中等程度的交互效應(yīng)。 4)多個(gè)候選通路、基因、SNP進(jìn)行交互效應(yīng)分析，M

8、DR最佳模型中包括5個(gè)SNP：A1267G，A663T，C—344T，A2350G和A—240T。進(jìn)行單倍型分析，經(jīng)Bonferroni校正(P<0.0028，0.05/18)，發(fā)現(xiàn)在HAPE組中單倍型H6(A—A-T—A—A，等位基因按A—240T，A2350G，C—344T，A1267G和A663T順序組合單倍型)的頻率顯著高于HC組(7.2％vs．0.9％，P=0.0002)。 第二部分、轉(zhuǎn)鐵蛋白相關(guān)等位基因及其單倍型的功

9、能研究。 目的： 本文比較分析HAPE患者及HC個(gè)體的血漿蛋白質(zhì)組分的差異，將HAPE患者特異變化的血漿蛋白質(zhì)的編碼基因作為目標(biāo)候選基因，研究其與HAPE發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究：通過柱層析除去高豐度的血漿白蛋白，采用雙向電泳和質(zhì)譜分析比較兩組中血漿蛋白質(zhì)組分和含量的變化，鑒定出差異顯著的蛋白質(zhì)種類。結(jié)果顯示，HAPE組中轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，TF)含量水平較HC組明顯升高。 群體關(guān)聯(lián)

10、研究：根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果，HAPE患者血漿TF水平較HC組有明顯升高。推測有以下可能：①HAPE患者TF變異，不能與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，TFR)結(jié)合，致使血漿中TF增多；或TFR結(jié)構(gòu)變異。②TF基因調(diào)控區(qū)多態(tài)性，在環(huán)境因素作用下使其表達(dá)調(diào)控水平改變。③或其它。本文的研究方向主要從基因調(diào)控方面著手。采用基因組學(xué)研究方法，對兩組的TF基因啟動子區(qū)和第一內(nèi)含子區(qū)的全序列進(jìn)行測定并比較分析，發(fā)現(xiàn)7個(gè)SNP

11、，分別為A—740G，G—618A，G—552A，T+463C，A+1138G，G+1649A單核苷酸取代和G—35T單堿基顛換。 應(yīng)用病例—對照關(guān)聯(lián)分析方法發(fā)現(xiàn)： (1)除G—35T和G+1649A位點(diǎn)的基因型頻率在HAPE組高于HC組外，未見其余SNP的基因頻率在兩組有明顯差異。 (2)單倍型分析結(jié)果表明：根據(jù)MDR分析結(jié)果，選擇存在明顯交互效應(yīng)的啟動子區(qū)4個(gè)SNP進(jìn)行單倍型分析。主要存在9種單倍型，其中HA

12、PE組單倍型H4(G—G—G-T，等位基因按照A—740G，G—618A，G—552A和G—35T順序組合單倍型)頻率顯著高于HC組(P=0.0085)，說明其與HAPE易感相關(guān)；相反，HC組單倍型H6(A—G—A-T)頻率顯著高于HAPE組(P=0.0012)，提示該單倍型攜帶者不易患HAPE，是其抗性基因組合。 轉(zhuǎn)錄活性研究：為進(jìn)一步證實(shí)和解釋遺傳關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果，鑒定存在于TF基因鄰近啟動子區(qū)的SNP及其不同單倍型對基因調(diào)控

13、區(qū)轉(zhuǎn)錄活性的影響，本研究構(gòu)建了含TF基因鄰近啟動子區(qū)不同單倍型的螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞并測定其瞬時(shí)表達(dá)螢光素酶活性，對TF基因鄰近啟動子區(qū)的4種主要單倍型的序列進(jìn)行功能研究，以期進(jìn)一步闡明基因結(jié)構(gòu)和表型之間的內(nèi)在聯(lián)系。 1)螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。 從基因組DNA中用PCR方法擴(kuò)增，獲得含有人TF基因5’上游調(diào)控區(qū)不同單倍型的片段。所得目的片段亞克隆入pMD18-T vector。

14、將pGL3—Basic/Enhancer vector和重組pMD18-T質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后得到的含粘端的片段相連接，得到含不同單倍型的人TF基因5’上游調(diào)控區(qū)序列的螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒。 2)人肺腺癌A549細(xì)胞系的培養(yǎng)及誘導(dǎo)過程。 HAPE是一種非心源性水腫，主要受累組織器官是肺臟，故采用人肺腺癌A549細(xì)胞系作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。 3)不同單倍型對轉(zhuǎn)錄活性的影響。 利用真核基因轉(zhuǎn)染技

15、術(shù)，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞，探討位于TF基因5’調(diào)控區(qū)的SNP及其單倍型組合對報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。 4)低氧環(huán)境下不同單倍型對轉(zhuǎn)錄活性的影響。 為進(jìn)一步說明基因結(jié)構(gòu)對HAPE發(fā)生的影響，本研究模擬低氧環(huán)境(環(huán)境物理低氧：3％O2和細(xì)胞化學(xué)低氧：100μmol/L CoCl2)，將含有TF基因鄰近啟動子區(qū)的4種主要單倍型序列的螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549

16、細(xì)胞，在不同低氧環(huán)境下培養(yǎng)，分別測定螢光素酶活性。結(jié)果顯示，在低氧條件下，含易感單倍型重組質(zhì)粒的報(bào)告基因活性高于含抗性單倍型重組質(zhì)粒，且低氧條件下重組質(zhì)粒報(bào)告基因的表達(dá)水平高于常氧環(huán)境，具有一定的時(shí)間依賴性。 總之，本研究利用群體關(guān)聯(lián)方法分析了3個(gè)候選通路中9個(gè)候選基因的18個(gè)SNP與HAPE易感相關(guān)性。結(jié)果表明，單個(gè)位點(diǎn)與HAPE的易感相關(guān)性較弱，采用單倍型分析和多元簡約法發(fā)現(xiàn)HSP70A1B基因A1267G，SCNN1A基因

17、A663T，CYP11B2基因C—344T，ACE基因A2350G和A—240T多態(tài)位點(diǎn)之間的交互效應(yīng)與HAPE易感相關(guān)。此結(jié)果提示在HAPE的遺傳學(xué)研究中多位點(diǎn)的單倍型分析及基因—基因交互作用的估計(jì)較單個(gè)位點(diǎn)的分析具有潛在優(yōu)勢。同時(shí)本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)及基因組學(xué)研究分析了HAPE組與HC組中血漿蛋白質(zhì)組分的表達(dá)差異，鑒定并選擇TF基因作為候選基因，研究其與HAPE易感相關(guān)性。應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄研究從功能水平闡明基因結(jié)構(gòu)和表型之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性