教育hiv艾滋病抗體實(shí)室檢測方法hiv上崗證培訓(xùn)

1、主要內(nèi)容,HIV檢測一般情況：窗口期、檢測樣本及流程關(guān)于樣本實(shí)驗(yàn)室操作：采集、處理、檢測、轉(zhuǎn)運(yùn)常用篩查方法,艾滋病檢測意義,艾滋?。河绊懭祟惤】档娜蛐詾?zāi)難我國艾滋病的流行形勢也日趨嚴(yán)峻據(jù)估算，我國大約只有10%艾滋病病毒感染者被發(fā)現(xiàn)，其余90%處于未知狀態(tài)，這對相關(guān)的預(yù)防、治療和關(guān)懷工作帶來極大挑戰(zhàn)要找到尚未發(fā)現(xiàn)的感染者，實(shí)驗(yàn)室檢測工作必不可少,感染HIV后的血清學(xué)變化,,,,,HIV RNA,濃度,,,,抗體,感染,

2、1周 2周 6周 12周 -年,窗口期,窗口期：機(jī)體感染HIV到能檢出抗體之間的時(shí)期 第三代HIV抗體檢測試劑盒能使大部分感染者在4-8周后檢測出HIV抗體如果到12周（即3個(gè)月）仍檢測不出抗體，基本可以排除HIV感染，對抗體檢測呈不確定反應(yīng)或高危行為后高度懷疑有感染危險(xiǎn)者，可再隨訪3個(gè)月后復(fù)檢。必要時(shí)可做HIV-1 p24抗原或HIV核酸檢測作為輔助診斷,,檢

3、測樣品： 血液、組織液、排泄物、組織、器官、精液以及有關(guān)血液制品、生物組織或其它物品等 進(jìn)行艾滋病病毒HIV或其相應(yīng)標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)室測定，包括HIV分離、抗原檢測、核酸檢測和抗體檢測等目前用于HIV診斷的常規(guī)方法為血液中HIV抗體檢測，我國目前檢測血液中HIV抗體的常規(guī)檢測程序分為篩查試驗(yàn)（包括初篩和復(fù)檢）和確認(rèn)試驗(yàn),HIV抗體篩查實(shí)驗(yàn)流程圖,,樣本,陽性反應(yīng),一陰一陽,陰性反應(yīng),篩查檢測,均陽性反應(yīng),重復(fù)檢測,均陰性反應(yīng)

4、,送確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn),陰性報(bào)告,篩查試劑,原有試劑加另外一種篩查試劑,,,,,,,,,,,,,,,,,設(shè)備要求,主要儀器設(shè)備包括 生物安全柜、離心機(jī)、酶標(biāo)讀數(shù)儀、洗板機(jī)、移液器、溫箱/水浴箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器所用的儀器應(yīng)該校準(zhǔn)，每次使用后應(yīng)做記錄為保證人員安全，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的耗材最好使用塑料制品,標(biāo)本要求,1．種類：血清或血漿(肝素、枸櫞酸鈉或EDTA抗凝)。2．量： 靜脈血2ml，常規(guī)分離血清或血漿。

5、 3. 3000轉(zhuǎn)／分離心10分鐘。4．保存：分離后7d之內(nèi)測定的血清或血漿標(biāo)本可放置于 2?8?C保存，超過7d在-20?C保存。,試劑要求,我國規(guī)定HIV抗體篩查試劑必須是：HIV-1/2混合型經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準(zhǔn)批批檢合格在有效期內(nèi)推薦使用臨床質(zhì)量評估敏感性和特異性高的試劑 （chinaids.org）,常用篩查方法,目前，國內(nèi)常用的HIV抗體篩查試驗(yàn)方法有：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（E

6、LISA）顆粒凝集試驗(yàn)?。≒A）快速試驗(yàn),雙抗原夾心法原理,,,試劑盒組成（雙抗原夾心法ELISA）,1.HIV酶標(biāo)板2.HIV-1型陽性對照 3.HIV-2型陽性對照 4.HIV陰性對照 5.HIV酶標(biāo)試劑 6.濃縮洗滌液 7.顯色劑A液 8.顯色劑B液 9.終止液,操作程序 - 1,閱讀標(biāo)準(zhǔn)操作程序，嚴(yán)格按照試劑說明書操作將試劑盒及樣品放置在室溫半小時(shí)以上1）準(zhǔn)備酶標(biāo)板，小心撕去酶標(biāo)板條上的封

7、條2）配液：將50ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋至1000ml備用。3）編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板應(yīng)設(shè)陰性對照3孔、陽性對照1型,2型各1孔、空白1孔。4）加樣：分別在相應(yīng)孔中加入加入100 μl待檢樣品及陰、陽性對照、外部質(zhì)控對照。,操作程序 - 2,5）溫育：用封板膜封板后置37±1℃溫育60±1分鐘。 6）洗滌：小心將封板膜揭掉，使用洗板機(jī)吸干孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌5遍，拍干。7）

8、加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白孔除外。8）溫育：用封板膜封板后置37±1℃溫育30±1分鐘。9)洗滌：小心將封板膜揭掉，使用洗板機(jī)吸干孔內(nèi)液體，用洗滌液充分洗滌5遍，最后一次盡量拍干。。,操作程序 - 3,10）顯色：每孔加入顯色劑A、B液各50μl，輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置37±1℃避光顯色30±1分鐘。12）測定：每孔加終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀波長于45

9、0nm處（建議用雙波長檢測，可不設(shè)空白），在15分鐘內(nèi)測定各孔OD值。13）用酶標(biāo)儀測定OD值，打印結(jié)果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷（1）,檢查陰性對照和陽性對照的OD值是否符合要求，判斷本次實(shí)驗(yàn)是否成立，并計(jì)算cut off值結(jié)果判定:1.陰性對照的正常范圍： 正常情況下，陰性對照孔OD值≤0.10。2.陽性對照的正常范圍： 正常情況下，陽性對照孔OD值≥0.80。3.臨界值（CUTOFF）計(jì)算： 臨界值=陰

10、性對照孔OD均值Nc + 0.12。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷（2）,4.陽性判定：樣品OD值≥臨界值（CUTOFF）者為HIV 抗體陽性 （注意：初試陽性標(biāo)本應(yīng)重新取樣進(jìn)行雙孔復(fù)檢，復(fù)試陽性者應(yīng)按“全國HIV檢測管理規(guī)范”送HIV確證實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)）。5.陰性判定：樣品OD值＜臨界值（CUTOFF）者為HIV抗體陰性。,質(zhì)控要求,一.室內(nèi)質(zhì)控：1. 在每次HIV實(shí)驗(yàn)中必須包含內(nèi)部對照質(zhì)控血清（試劑盒配套質(zhì)控）: HIVI抗體、HI

11、V2抗體陽性質(zhì)控、HIV陰性質(zhì)控及外部對照質(zhì)控血清（自制或購買）。2.所有質(zhì)控品與標(biāo)本同時(shí)加入HIV試劑的微孔板內(nèi)，最終質(zhì)控結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果可報(bào)告；否則應(yīng)重新檢測標(biāo)本。,,檢測過程中的問題及對策,ELISA實(shí)驗(yàn)所有的孔均無色,漏加陽性對照酶標(biāo)記物失效底物失效：應(yīng)避光保存酶聯(lián)板抗原失效,ELISA實(shí)驗(yàn)所有的孔均顯色,洗板不徹底，孔內(nèi)殘留未結(jié)合的酶標(biāo)記物。容器不清潔，有殘留物質(zhì)：酶受污染。底物失效，在加入之前就已經(jīng)顯