豆豉發(fā)酵過程中菌群分析及功能菌株的篩選.pdf

1、曲霉型豆豉是中國傳統(tǒng)的調(diào)味品，具有營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)。目前，曲霉型豆豉生產(chǎn)方式仍然是生產(chǎn)工藝落后的傳統(tǒng)自然發(fā)酵，這會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定、發(fā)酵過程易引入致病菌等問題。本文主要對(duì)傳統(tǒng)曲霉型豆豉自然發(fā)酵過程中的微生物多樣性進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析及功能優(yōu)勢菌的篩選和鑒定，并對(duì)纖溶酶產(chǎn)生菌的纖溶酶發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化及對(duì)纖溶酶進(jìn)行純化和表征，主要研究結(jié)果如下：
　?。?）采用 Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對(duì)豆豉制曲階段和發(fā)酵階段的

2、微生物多樣性進(jìn)行研究。結(jié)果得到181,443條高質(zhì)量的細(xì)菌16S rDNA序列和221,059條真菌的ITS序列，將序列進(jìn)行分類得到8個(gè)細(xì)菌門和3個(gè)真菌門。在門水平，厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）是豆豉發(fā)酵過程中細(xì)菌的優(yōu)勢菌門，子囊菌門（Ascomycota）和接合菌門（Zygomycota）是真菌的優(yōu)勢菌門。在屬水平，葡萄球菌屬（Staphyloco

3、ccus）和魏斯氏菌屬（Weissella）是優(yōu)勢菌屬，而曲霉屬（Aspergillus）和橫梗霉屬（Lichtheimia）是優(yōu)勢菌屬，在豆豉發(fā)酵過程中其它重要優(yōu)勢菌的細(xì)菌屬包括不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）?；诩訖?quán)和未加權(quán)的主成分分析（PCoA）可知，細(xì)菌和真菌的菌

4、群結(jié)構(gòu)在制曲和發(fā)酵階段并沒有差別（P>0.05）。然而，未加權(quán)的多變量方差分析（MANOVA）和熱圖及RDA分析顯示，細(xì)菌群落在制曲和發(fā)酵階段有差別（P<0.05），而這種差別的就是由于制曲階段葡萄球菌屬（Staphylococcus）和發(fā)酵階段的黃金桿菌屬（chryseobacterium）這兩種菌的豐度分布造成的。
　?。?）采用平板分離技術(shù)對(duì)豆豉發(fā)酵過程中的功能菌進(jìn)行了分離純化，并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，成功分離得到產(chǎn)蛋白酶的解

5、淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、產(chǎn)纖溶酶的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、產(chǎn)酒精的酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、產(chǎn)乳酸的乳酸菌（Pediococcus lolii）。然后，重點(diǎn)對(duì)其中一株高產(chǎn)纖溶酶的菌株Bacillus amyloliquefaciens Jxnuwx-1產(chǎn)纖溶酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過 De

6、sign-Expert軟件對(duì)玉米淀粉、牛肉粉、初始pH這三個(gè)較顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，最終獲得最佳發(fā)酵條件為：玉米淀粉濃度為2.91%，牛肉粉的濃度為1.76%，最適pH為7.47，在此條件下，酶活力為346.62 IU/mL，較優(yōu)化前纖溶酶活力提高了8.9倍。
　?。?）利用蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)對(duì)解淀粉芽孢桿菌Jxnuwx-1的纖溶酶進(jìn)行純化，經(jīng)過硫酸銨鹽析、陰離子交換和凝膠層析步驟得到了電泳純級(jí)別的纖溶酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該纖溶酶相

7、對(duì)分子質(zhì)量為29 kDa，最適溫度和最適pH分別為41℃和7.6，該酶會(huì)被PMSF、SBTI、EDTA、Fe3+、Fe2+所抑制，相比于其他的酰胺特異性底物，該酶對(duì)絲氨酸特異性底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA具有很強(qiáng)的催化作用，說明該酶是金屬絲氨酸蛋白酶型的纖溶酶，該酶能夠快速降解纖維蛋白（原）的Aα亞基，緊接著是Bβ和Cγ亞基，該酶既可以直接降解纖維蛋白（原）又可以作為纖溶酶原激活因子，這種類型的纖溶酶