南極大磷蝦胰蛋白酶分離純化及其促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)作用研究.pdf

1、南極大磷蝦(Euphausia superba)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱，是生活在南極海域的一種嗜冷生物，以其巨大的生物量和潛在的應(yīng)用價(jià)值日益受到人們的關(guān)注。南極大磷蝦體內(nèi)含有多種蛋白酶，蛋白降解系統(tǒng)較為獨(dú)特而且降解效率較高，而這些蛋白酶活性40％來(lái)源于胰蛋白酶。其胰蛋白酶是一種適冷酶，在低溫下具有較高的催化活性，并且具有較低的最適催化溫度，由于南極大磷蝦體內(nèi)蛋白酶系統(tǒng)同時(shí)具有外切酶和內(nèi)切酶活性，用于清除壞死機(jī)體組織、纖維以及血痂非常有效

2、，能顯著加快傷口愈合，因此，南極大磷蝦酶制劑具有廣泛的醫(yī)學(xué)用途。
　　 本實(shí)驗(yàn)從南極大磷蝦體內(nèi)提取胰蛋白酶。通過(guò)采用20-70％硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析、Sephacry1 S100凝膠過(guò)濾層析，然后將樣品進(jìn)行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)純化得到一種分子量為32.0KDa的胰蛋白酶組分，作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所用的純化酶。
　　 采用全層皮膚缺損法建立新西蘭大白兔創(chuàng)傷模型，在兔背后造

3、4個(gè)約2cm×2cm方形創(chuàng)面，將創(chuàng)面分為粗酶組、純化酶組、木瓜蛋白酶組和生理鹽水組四組，每天給藥兩次，每次0.5mL，直至傷口愈合。連續(xù)觀察創(chuàng)面形態(tài)學(xué)變化，評(píng)價(jià)創(chuàng)傷表面瘢痕、測(cè)量傷口表面積、觀察創(chuàng)傷組織切片、測(cè)定皮膚羥脯氨酸含量比較各組創(chuàng)傷愈合效果。結(jié)果顯示，相比于木瓜蛋白酶，從南極大磷蝦中提取的粗酶和純化的胰蛋白酶具有良好的促進(jìn)愈合效果，尤其是粗酶，能明顯促進(jìn)動(dòng)物創(chuàng)面的愈合，并明顯縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，還能顯著提高在創(chuàng)傷15天羥脯氨酸含量

4、。初步表明南極磷蝦胰蛋白酶有增加膠原沉積，增加蛋白質(zhì)合成，加速上皮組織再生，促進(jìn)肉芽組織形成等作用。
　　 EGF及bFGF是影響創(chuàng)傷修復(fù)的兩種比較關(guān)鍵的生長(zhǎng)因子。測(cè)定表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)含量。建模后第十天、十五天，粗酶組和純化酶組EGFR、bFGF的表達(dá)水平較高，相較于木瓜蛋白酶組和生理鹽水組差異顯著，且粗酶組EGFR、bFGF的表達(dá)速度最快(10天左右達(dá)到最高峰)，因而認(rèn)為粗酶可能通過(guò)調(diào)