基于UPS與（抑）癌基因交互作用的腫瘤靶向治療策略與調(diào)控機(jī)制初探.pdf

1、第一部分、嵌合泛素連接酶SH2-U-box靶向降解慢粒白血病中BCR-ABL及其突變的治療策略
　　背景：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-Proteasome System,UPS）是真核生物內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑。通過促進(jìn)底物蛋白質(zhì)的泛素化降解，UPS參與調(diào)控幾乎所有的細(xì)胞內(nèi)過程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等。在生理狀態(tài)下，UPS的正常運(yùn)行對(duì)于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能維持至關(guān)重要，UPS異常與多種人類重大疾病如腫瘤、神經(jīng)

2、退行性變密切相關(guān)。因此，基于UPS的疾病治療策略一直方興未艾。
　　UPS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程包括蛋白質(zhì)泛素化和蛋白酶體降解兩個(gè)環(huán)節(jié)。在泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3三種酶的協(xié)同作用下，由ATP供能，泛素分子（Ubiquitin，Ub）以共價(jià)鍵與底物蛋白質(zhì)結(jié)合使后者發(fā)生泛素化。通常K48-多聚泛素鏈作為蛋白質(zhì)降解信號(hào)，促使被修飾的蛋白質(zhì)在蛋白酶體中降解。由于E3含底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域/亞基，可特異性識(shí)別并結(jié)合底物蛋白質(zhì)，

3、決定著蛋白質(zhì)泛素化降解的特異性。利用E3的上述特性，通過精心設(shè)計(jì)和人為改變其底物識(shí)別特異性，理論上能夠?qū)崿F(xiàn)降解任意蛋白質(zhì)，這一從蛋白質(zhì)水平調(diào)控目的蛋白質(zhì)含量的策略被喻為“靶向性蛋白質(zhì)敲除”，在蛋白質(zhì)功能研究以及疾病相關(guān)蛋白質(zhì)靶向治療策略中極具應(yīng)用前景。以腫瘤相關(guān)蛋白作為分子靶點(diǎn)一直是腫瘤靶向性治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，其他研究者和我們一直在積極嘗試和探索多種靶向性降解消除致癌蛋白的新策略。
　　慢性粒細(xì)胞白血?。–hronic myel

4、oid leukemia,CML）是一類發(fā)生于造血系統(tǒng)的克隆型疾病，其標(biāo)志性特征是由染色體易位產(chǎn)生融合基因 Bcr-Abl，編碼致癌性BCR-ABL融合蛋白。BCR-ABL具有持續(xù)過度活化的酪氨酸激酶活性，通過募集Grb2(growth factor receptor-bound protein2)等接頭蛋白，激活下游PI3K-Akt、MAPK、STAT5等多條信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖等惡性行為。因此，BCR-ABL也是CML治療的重

5、要靶分子。針對(duì)BCR-ABL的第一代酪氨酸激酶抑制劑Imatinib盡管對(duì)始發(fā)CML的療效令人鼓舞，但隨之出現(xiàn)的Imatinib耐藥成為了CML治療所面臨的突出問題。導(dǎo)致Imatinib耐藥的主要原因是發(fā)生于BCR-ABL激酶區(qū)的點(diǎn)突變，這些突變多達(dá)40余種，其中以BCR-ABL T315I最為常見和難治，對(duì)第二代抑制劑如達(dá)沙替尼甚至第三代抑制劑如伯舒替尼均耐藥。因此，尋找針對(duì)BCR-ABL及其突變的新策略仍然是治療CML的挑戰(zhàn)。

6、>　　目的：本研究中我們以CML中的致癌蛋白BCR-ABL及其耐藥突變體作為靶點(diǎn)，通過將能夠識(shí)別并結(jié)合 BCR-ABL及其耐藥突變的Grb2 SH2結(jié)構(gòu)域與 E3泛素連接酶CHIP的催化結(jié)構(gòu)域U-box進(jìn)行融合，構(gòu)建嵌合泛素連接酶SH2-U-box，以實(shí)現(xiàn)特異性泛素化、降解BCR-ABL及其耐藥突變體，進(jìn)而抑制CML并克服Imatinib耐藥。
　　方法與結(jié)果：
　　1.嵌合泛素連接酶SH2-U-box能夠與BCR-ABL及

7、T315I結(jié)合，并促進(jìn)其泛素化降解
　　將能識(shí)別和結(jié)合BCR-ABL及其突變的SH2結(jié)構(gòu)域與具有E3催化功能的結(jié)構(gòu)域U-box通過重組PCR融合，構(gòu)建為嵌合泛素連接酶SH2-U-box，以SH2（不含U-box）作為對(duì)照。通過電轉(zhuǎn)的方式導(dǎo)入表達(dá)BCR-ABL的K562細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞株K562R（含T315I），Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照相比SH2-U-box能夠顯著下調(diào)BCR-ABL及其突變T315I的蛋白水平；R

8、eal-time PCR結(jié)果則表明上述分子mRNA水平并未發(fā)生變化。
　　將表達(dá)SH2-U-box或SH2的質(zhì)粒pFLAG-CMV4、與表達(dá)BCR-ABL或T315I的質(zhì)粒pcDNA3.1(-)，共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明SH2-U-box和SH2均能夠與BCR-ABL或T315I結(jié)合；泛素化實(shí)驗(yàn)則表明：SH2-U-box能夠顯著提高靶分子的泛素化，但SH2不具有該作用。CHX蛋白追蹤實(shí)驗(yàn)表明SH2-U-box較S

9、H2明顯縮短BCR-ABL及T315I的半衰期，且該作用可被蛋白酶體抑制劑MG132削弱。
　　2.SH2-U-box穩(wěn)定表達(dá)可下調(diào)BCR-ABL及其下游信號(hào)通路，抑制K562及K562R的生長，在K562中與Imatinib具有疊加作用
　　進(jìn)一步利用慢病毒系統(tǒng)建立了穩(wěn)定表達(dá)eGFP，SH2或SH2-U-box的K562/K562R細(xì)胞，在這些細(xì)胞中采用Western blot證實(shí)SH2-U-box促進(jìn)BCR-ABL及T3

10、15I的降解，下調(diào)其磷酸化水平；BCR-ABL下游STAT5、PI3K-Akt、MAPK信號(hào)通路的活化以及抗凋亡分子Bcl-xL均受到抑制。
　　上述細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)SH2-U-box、SH2或eGFP的K562/K562R細(xì)胞，以Imatinib處理或不處理，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果表明，與對(duì)照eGFP組相比，SH2-U-box而非其 SH2，能夠顯著抑制K562和K562R的生長。在K562細(xì)胞中，SH2-U-box與Im

11、atinib聯(lián)用能夠協(xié)同抑制細(xì)胞增殖。
　　過表達(dá)SH2-U-box或SH2的K562和K562R細(xì)胞施以Imatinib處理，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果表明，SH2-U-box表達(dá)可增加K562和K562R細(xì)胞G1期、降低S期比例，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；在K562細(xì)胞中，SH2-U-box同樣表現(xiàn)出與Imatinib的協(xié)同作用。
　　3.SH2-U-box能夠在動(dòng)物水平抑制K562及K562R皮下移植瘤的生長，并能抑制C

12、ML臨床病人原代細(xì)胞的生長
　　我們分別在裸鼠和重癥免疫缺陷小鼠建立了K562和K562R的皮下荷瘤模型，待瘤體可見時(shí)，施以SH2-U-box或SH2慢病毒瘤體原位注射，監(jiān)測(cè)腫瘤生長情況。結(jié)果表明SH2-U-box處理組的腫瘤生長速度和瘤體質(zhì)量明顯小于SH2組。瘤體組織蛋白的Western blot結(jié)果顯示：與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，SH2-U-box處理組BCR-ABL及下游信號(hào)p-STAT5，p-Akt，pERK等均抑制，SH2-U

13、-box處理組可檢測(cè)出PARP切割條帶。瘤體組織的免疫組化結(jié)果表明SH2-U-box組的瘤體組織中Ki-67陽性較SH2處理組明顯降低。
　　利用梯度離心法從兩例CML確診病人的骨髓中提取單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。以攜帶SH2-U-box或SH2慢病毒感染原代細(xì)胞，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力表明SH2-U-box能夠明顯抑制原代細(xì)胞的增殖，Western blot檢測(cè)結(jié)果表明在原代細(xì)胞中，SH2-U-box能夠明顯下調(diào)BCR-ABL和p-BC

14、R-ABL及下游信號(hào)p-STAT5，p-Akt。
　　結(jié)論：SH2-U-box能夠有效結(jié)合BCR-ABL及耐藥突變BCR-ABL（T315I），促進(jìn)它們發(fā)生泛素化并在蛋白酶體中降解，進(jìn)而削弱相應(yīng)的下游信號(hào)通路；從而抑制CML及其耐藥細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡；在K562細(xì)胞中，SH2-U-box還能夠與Imatinib聯(lián)用協(xié)同抑制腫瘤；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和原代CML實(shí)驗(yàn)亦表明，SH2-U-box能夠抑制CML生長。該研究豐富和完善了靶向

15、泛素化、降解致病相關(guān)蛋白這一治療策略的理論基礎(chǔ)，并為BCR-ABL陽性尤其是對(duì)已有治療方案耐藥的CML治療提供了新思路和方法。
　　第二部分、MIIP與UPS交互作用探索及其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用與機(jī)制
　　背景：前列腺癌（Prostatecancer，PCa）是男性最常見的惡性腫瘤，根據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，PCa位居男性腫瘤發(fā)病率第二、死亡率第六。盡管手術(shù)、激素治療以及放化療在臨床已經(jīng)廣為應(yīng)用，但對(duì)于進(jìn)展期和轉(zhuǎn)移 PCa仍

16、缺乏較好的治療方案。因此闡明PCa發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的干預(yù)策略，一直是PCa基礎(chǔ)和臨床研究的焦點(diǎn)。
　　MIIP（Migration and Invasion Inhibitory Protein）是研究者最早在膠質(zhì)瘤中報(bào)道的IGFBP2的相互作用分子，因其具有抑制腫瘤細(xì)胞遷移侵襲作用而命名。MIIP基因位于染色體1p36.22，在乳腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌等多種腫瘤中都檢測(cè)到了該段染色體的缺失。MIIP編碼的

17、蛋白由388個(gè)氨基酸構(gòu)成，包含RGD結(jié)構(gòu)域和幾個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)。已有的研究表明，MIIP在膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中低表達(dá)，通過與不同分子結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲、染色體不穩(wěn)定性等腫瘤惡性特征，抑制腫瘤進(jìn)展，提示MIIP具有抑癌功能，但在不同類型腫瘤中，其作用環(huán)節(jié)和機(jī)制遠(yuǎn)未闡明。
　　UPS（Ubiquitin-Proteasome System）異常、EMT（Epithelial-Mesenchymal Tran

18、sition）等在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已被廣泛認(rèn)可，并逐漸成為腫瘤治療的重要干預(yù)靶位。一些抑癌基因產(chǎn)物可通過直接或間接調(diào)控上述過程而發(fā)揮抑癌功能。研究表明前列腺癌特別是去勢(shì)抵抗階段腫瘤細(xì)胞蛋白酶體活性明顯升高，但其具體的調(diào)控方式和機(jī)制并不清楚。
　　目的：本部分研究中，我們初步探索了MIIP對(duì) UPS的調(diào)控作用以及對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、EMT等惡性生物學(xué)行為的影響。從臨床標(biāo)本、前列腺癌細(xì)胞系、荷瘤鼠四個(gè)層面研究了MIIP的抑癌

19、作用。
　　方法與結(jié)果：
　　1.MIIP在PCa組織中低表達(dá)
　　我們對(duì)21例前列腺癌患者的組織中檢測(cè)MIIP的蛋白水平，MIIP在半數(shù)以上（11/21）的患者癌組織中較癌旁組織下調(diào)，其中7例MIIP表達(dá)的下調(diào)較為明顯。
　　2.MIIP能夠抑制PCa細(xì)胞蛋白酶體活性
　　為明確MIIP在前列腺癌中的作用，我們建立了穩(wěn)定表達(dá)MIIP的C4-2和LNCap細(xì)胞系，CCK8細(xì)胞活力檢測(cè)表明MIIP可抑制細(xì)胞生

20、長，蛋白酶體活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MIIP過表達(dá)能夠明顯抑制PCa細(xì)胞的Chymotrypsin-like活性。
　　3.MIIP抑制PCa細(xì)胞的生長和侵襲，抑制腫瘤細(xì)胞的EMT
　　我們?cè)贒U145和PC3細(xì)胞中，通過轉(zhuǎn)染MIIP過表達(dá)質(zhì)粒和MIIP siRNA調(diào)變MIIP。MTT、克隆形成、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明MIIP過表達(dá)明顯抑制DU145和PC3細(xì)胞增殖、克隆形成能力和侵襲能力，而MIIP敲低則相反。
　　We

21、stern blot結(jié)果表明敲低MIIP能夠顯著抑制上皮標(biāo)志E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間充質(zhì)標(biāo)志N-cadherin，Vimentin的表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果也表明敲低MIIP后，CDH1（編碼E-cadherin）和CDH2（編碼N-cadherin）的變化與蛋白質(zhì)一致，SNAI1, SNAI2以及TWIST1的mRNA水平也有所上調(diào)。在MIIP過表達(dá)的DU145和PC3中，E-cadherin的蛋白水平上調(diào)而

22、N-cadherin則下調(diào)。
　　4.穩(wěn)定敲低MIIP促進(jìn)裸鼠體內(nèi)的前列腺癌移殖瘤生長
　　我們利用MIIP shRNA慢病毒建立了穩(wěn)定敲減MIIP的DU145和PC3細(xì)胞系，MIIP穩(wěn)定敲低的細(xì)胞在顯微鏡下表現(xiàn)為間充質(zhì)樣并分散生長，Western blot和real-time PCR表明MIIP穩(wěn)定敲低對(duì)EMT標(biāo)記分子以及SNAI1等的影響與瞬時(shí)敲低一致。
　　裸鼠皮下注射上述細(xì)胞系建立荷瘤模型，監(jiān)測(cè)腫瘤生長，發(fā)現(xiàn)M

23、IIP穩(wěn)定敲低的DU145和PC3生長與對(duì)照相比較快，30天后MIIP穩(wěn)定敲減組的瘤體質(zhì)量也較重。瘤體組織的Western blot實(shí)驗(yàn)表明MIIP敲低的瘤體組織中MIIP表達(dá)較低，免疫組化結(jié)果表明MIIP敲低組中Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多。
　　結(jié)論：本部分研究首次證實(shí)新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因MIIP在前列腺癌中通過調(diào)控EMT和UPS，抑制前列腺癌的惡性進(jìn)程。我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MIIP能夠抑制PCa細(xì)胞蛋白酶體活性，并上調(diào)E-cadhe