抗重金屬鎘、鉛單克隆抗體、單鏈抗體的研制及單鏈抗體三維結(jié)構(gòu)的模建.pdf

1、重金屬是一類很危險(xiǎn)的污染物，在生物體內(nèi)長(zhǎng)期積累不可降解，在極其微量的情況下也會(huì)產(chǎn)生不良后果。各種生態(tài)系統(tǒng)都不同程度受到重金屬的影響。重金屬通過(guò)食物鏈沉積到人體中，可引起各種疾病甚至癌癥，危害還能遺傳到下一代。因此重金屬在環(huán)境、農(nóng)產(chǎn)品中殘留監(jiān)測(cè)都是非常重要的。 本文旨在建立能穩(wěn)定分泌高親和力、高特異性抗重金屬鎘和鉛單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，在對(duì)其親和力、特異性進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上，建立其免疫分析方法并得到初步應(yīng)用，克隆抗重金屬鎘、鉛

2、單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，構(gòu)建抗重金屬單鏈抗體基因，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定，利用計(jì)算機(jī)平臺(tái)和軟件進(jìn)行模擬分析抗鎘的單鏈抗體(SeFv)三維結(jié)構(gòu)。重金屬離子通過(guò)雙功能螯合劑與血藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原，免疫BALB/c鼠。采用雜交瘤技術(shù)建立能穩(wěn)定分泌高親和力抗重金屬鎘、鉛單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，大量制備并經(jīng)鹽析、蛋白親和層析獲得純化的單克隆抗體，間接ELISA法檢測(cè)效價(jià)，非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定親和力，競(jìng)爭(zhēng)E

3、LISA法測(cè)定抗體的特異性。采用矩陣實(shí)驗(yàn)確定抗原抗體的最佳組合，通過(guò)對(duì)離子強(qiáng)度、pH值、封閉物等影響因子的研究，確定酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)的最佳工作參數(shù)，建立定量測(cè)定金屬離子的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。在此基礎(chǔ)上，選擇雜交瘤細(xì)胞株，用Trizol試劑提取總RNA，通過(guò)RT-PCR，采用小鼠重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通用引物，擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因。通過(guò)重疊延伸PCR(SOE-PCR)將兩個(gè)可變區(qū)基因通過(guò)連接肽基因連接起來(lái)，構(gòu)建單鏈抗體基因

4、，克隆到pGEM-T Easy載體中，通過(guò)酶切、PCR和測(cè)序進(jìn)行鑒定。然后用限制性內(nèi)切酶雙酶切pGEM-metal-ScFv質(zhì)粒和pET-30a(+)質(zhì)粒，構(gòu)建pET-metal-ScFv重組表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，篩選陽(yáng)性菌株，通過(guò)酶切、PCR進(jìn)行鑒定。陽(yáng)性菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，分離包涵體，進(jìn)行變性和復(fù)性處理，通過(guò)SDS-PAGE和競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA對(duì)表達(dá)蛋白的分子量和活性進(jìn)行初步鑒定。在SWISS-MODEL

5、軟件服務(wù)器上，利用同源蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法模建單鏈抗體分子結(jié)構(gòu)，建立其三維結(jié)構(gòu)模型，運(yùn)用分子生物學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)，驗(yàn)證三維結(jié)構(gòu)的合理性。成功建立了七株能穩(wěn)定分泌抗鎘和鉛單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，獲得了高純度的單克隆抗體，蛋白濃度達(dá)1.58-5.0mg/mL，Aa6為IgG1亞類，其余的均為IgM亞類，親和力達(dá)10<'8>-10<'10>L/mol，選親和力高的抗體建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，抗體Aa6和4/7的IC<,50>分別為4.19μg/L和2.7

6、2μM，鎘和鉛的最低檢出重金屬鎘、鉛單克隆抗體、單鏈抗體的研制及抗體可變區(qū)三維結(jié)構(gòu)的模建濃度分別為0.313μg/L和0.056μM，自來(lái)水、超純水等水樣中重金屬標(biāo)準(zhǔn)液的添加回收率為80-114％。從雜交瘤細(xì)胞中成功地?cái)U(kuò)增出重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，采用重疊延伸PCR獲得約750bp大小的單鏈抗體基因，并克隆到T載體。經(jīng)測(cè)序證實(shí)，輕重鏈可變區(qū)基因均在300bp左右，輕重鏈之間是由45bp連接肽基因連接。然后，成功地將抗金屬ScFv基因按設(shè)計(jì)

7、的VH-linker-VL方向插入表達(dá)載體pET-30a(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽(yáng)性茵落經(jīng)ITPG誘導(dǎo)后，表達(dá)出目的蛋白，目的蛋白主要以包涵體形式存在，經(jīng)變性和復(fù)性處理，可獲得分子量大約29KD的蛋白但親和力不是很高，抑制率不超過(guò)10.6％。獲得抗體的分子結(jié)構(gòu)模型，單鏈抗體的輕、重鏈聯(lián)系精密且位置得當(dāng)，并可分析H鏈CDR3區(qū)主要的抗原結(jié)合位點(diǎn)。重金屬鎘、鉛單克隆抗體Aa6和4/7能有效地用于實(shí)驗(yàn)室水樣的重金屬鎘和鉛殘留檢測(cè)。從雜交瘤細(xì)胞株