抗重金屬鉻離子單克隆抗體的制備及阻斷ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、重金屬鉻具有肝臟、腎臟、生殖、遺傳、致癌等毒性作用。利用免疫分析技術(shù)檢測(cè)重金屬鉻離子是近年來新型的檢測(cè)分析方法，具有省時(shí)、省力、易于操作、攜帶方便、檢測(cè)費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，逐漸替代了傳統(tǒng)的理化檢測(cè)方法。本文在重金屬三價(jià)鉻離子免疫原性分析基礎(chǔ)上，合成了重金屬鉻離子人工抗原并進(jìn)行了鑒定，制備出了單克隆抗體并進(jìn)行了免疫學(xué)特性鑒定，建立了阻斷ELISA檢測(cè)方法并進(jìn)行了性能測(cè)定。
　　用異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE)螯合Cr3+形成Cr3

2、+-ITCBE螯合物半抗原，通過異硫氰酯法將該半抗原連接到牛血清白蛋白(BSA)和雞卵清蛋白(OVA)上制備成出人工免疫原 Cr3+-ITCBE-BSA和人工包被原 Cr3+-ITCBE-OVA。通過紫外分光光度法、SDS-PAGE電泳、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法和免疫小鼠后抗血清的ELISA鑒定：Cr3+-ITCBE-BSA和Cr3+-ITCBE-OVA的蛋白濃度分別為5.80mg/mL和7.69mg/mL， Cr3+含量分別為1

3、40.08μg/mL和175.40μg/mL；間接ELISA效價(jià)達(dá)到1∶5.12×104，阻斷ELISA檢測(cè)Cr3+-EDTA的半數(shù)抑制濃度(IC50)為28.81ng/mL，除與Mo6+-EDTA具有較強(qiáng)交叉反應(yīng)外，與EDTA及其它金屬離子螯合物無交叉反應(yīng)。
　　用Cr3+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠5只，5次免疫后用間接ELISA和阻斷ELISA選擇出細(xì)胞融合備用小鼠1只，應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)篩選出2A3C11、2A3

4、D9、2A3E5、2A3F2、2A11G5共5株敏感特異的雜交瘤細(xì)胞，用體內(nèi)誘生腹水法制備 Cr3+EDTA mAb，經(jīng)鑒定，其間接ELISA效價(jià)細(xì)胞培養(yǎng)上清分別為1∶2.56×103、1∶1.28×103、1∶2.56×103、1∶3.2×102、1∶2.56×103，腹水分別為1∶1.28×105、1∶2.56×105、1∶2.56×105、1∶1.28×105、1∶5.12×105，同種型間接ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果：5株雜交

5、瘤細(xì)胞分別為IgG1/κ、IgG2a/λ、IgG1/λ、IgG2a/κ、IgG1/κ，2A11G5親和常數(shù)（Ka）為2.69×109（L/mol），其中親和力最高的2A11G5株阻斷ELISA測(cè)定其IC50為25.12μg/L，與Mo6+-EDTA的交叉反應(yīng)率為22.13％，與其它金屬離子螯合物無交叉反應(yīng)。本試驗(yàn)制備的Cr3+-EDTA pAb和 Cr3+-EDTA mAb均可用于 Cr3+污染檢測(cè)的免疫學(xué)試驗(yàn)， Cr3+-EDTA m

6、Ab效果更好。
　　應(yīng)用Cr3+-EDTA mAb組裝出Cr3+污染快速檢測(cè)阻斷ELISA試劑盒(Cr3+ Kit)，Cr3+Kit的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈S型，符合4參數(shù)logit曲線擬合，試劑盒檢測(cè)靈敏度為3.23μg/L，檢測(cè)限為5.0μg/L，線性檢測(cè)范圍為5.0～512.0μg/L；飼料樣、豬尿樣、豬血清樣、自來水樣的平均添加回收率分別為85.97％、84.18％、81.13％和90.21％，平均批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15％；Cr