pcr實用技巧大全

1、PCRPCR實用技巧實用技巧20055139:37:19來源：互聯(lián)網(wǎng)增加PCR的特異性：1.primersdesign這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件a.足夠長1824bp以保證特異性.當然不是說越長越好太長的引物同樣會降低特異性并且降低產(chǎn)量b.GC%40%~~~~60%c.5端和中間序列要多GC以增加穩(wěn)定性d.避免3端GCrich最后3個BASE不要有GC或者最后5個有3個

2、不要是GCe.避免3端的互補否則容易造成DIMERf.避免3端的錯配g.避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)h.附加序列(RTsitePromotersequence)加到5端在算Tm值時不算但在檢測互補和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們i.使用兼并引物時要參考密碼子使用表注意生物的偏好性不要在3端使用兼并引物并使用較高的引物濃度(1uM3uM)j.最好學會使用一種designsoftware.PP5Oligo6DNAstarVectNTIOnlinedesgin

3、etal.引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近

4、鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點?？梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果

5、超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm重點到了：一般情況下是從55度開始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進行調(diào)整.有條件的可以做gradientpcr.退火的時間在3060S時間短一些可以得到更好的效果.因為polymerase在annealingtemp.時也會有一些活

6、性.所以在A.T.的時間過長會極大的增加非特異性擴增的風險，另外在對于一些困難戶比如從gDNA里擴增大片段還可使用twostepPCR.5.touchdownPCR原理很簡單但的確是一個很有用的方法。舉個例子，ANNEALINGTEMP.55度945min9430s6030s721min2cycles9430s5930s721min2cycles9430s5830s721min2cycles9430s5130s721min2cycles

7、9430s5030s721min20cycles725min6.hotstartPCR熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管TaqDNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如sitedirected

8、突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入TaqDNA聚合酶，在反應體系達到90度時，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這

9、個方法過于煩瑣，尤其是對高通量應用，并容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。=======================ampliwaxPCRGems(PerkinElmer)TaqBeadHotStartPolymerase(Promega)Magnesiumwaxb

10、eads(Stratagene).=========================象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。還有一種方法是使用inactiveDNAPolymerase.polymerase被抗體抑制失活，當變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。7.BoosterPCR我們知道1ughumangenomicDNA大約在3X105冪個模板分子這樣的模板分子