草魚抗菌免疫基因篩選及補(bǔ)體凝集素途徑基因功能研究.pdf

1、草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一。本論文利用高通量測序技術(shù)檢測了草魚感染嗜水氣單胞菌（AH10）脾臟轉(zhuǎn)錄組。篩選草魚抗菌免疫差異表達(dá)基因并研究了甘露糖結(jié)合凝集素（MBL）、甘露糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶1（MASP-1）和補(bǔ)體C2的功能。研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.草魚脾臟mRNA轉(zhuǎn)錄組測序分析
　　利用NextSeq500技術(shù)平臺(tái)，分別在7個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0h、4h、8h、12

2、h、24h、48h和72h）對(duì)腹腔注射AH10和PBS的草魚脾臟cDNA文庫進(jìn)行高通量測序。獲得149,514,670條raw reads，共42.67 G數(shù)據(jù)量。原始數(shù)據(jù)過濾后，共獲得122,181,346條 clean reads。經(jīng)過拼接和組裝后，191,795條基因注釋到Nr、KO、GO、KOG、Swiss-Port和eggNOG數(shù)據(jù)庫。通過篩選，獲得2,992個(gè)免疫相關(guān)差異表達(dá)基因。參與到免疫系統(tǒng)的差異表達(dá)基因大多富集到補(bǔ)體系

3、統(tǒng)中。基因差異表達(dá)分析和熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果表明：（1）草魚補(bǔ)體信號(hào)通路在抗菌免疫應(yīng)答中起到重要的作用；（2）補(bǔ)體系統(tǒng)在草魚感染4h后被激活；（3）補(bǔ)體基因mRNA呈波動(dòng)表達(dá)模式，表明草魚補(bǔ)體系統(tǒng)可能有信號(hào)傳遞的功能。
　　2. MBL在抗菌感染中介導(dǎo)的免疫應(yīng)答
　　MBL能激活補(bǔ)體凝集素途徑，在哺乳動(dòng)物和硬骨魚類中均起到重要的免疫作用。草魚MBL（gcMBL）的cDNA全長為984 bp，包含741 bp的開放閱讀框（O

4、RF），編碼246個(gè)氨基酸。gcMBL廣泛分布在草魚各組織中，表達(dá)量能被AH10、脂多糖（LPS）和鞭毛蛋白（FLA）影響。過表達(dá)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)除C5外，凝集素途徑的下游分子在轉(zhuǎn)錄水平上均顯著上調(diào)。用AH10、LPS和FLA分別刺激過表達(dá)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體受體、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白和炎癥相關(guān)因子的表達(dá)量均顯著上調(diào)。用 AH10侵染敲減gcMBL的肝臟原代細(xì)胞，與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，上述各因子的表達(dá)量均被抑制。利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)gcMBL

5、能顯著激活NF-κB信號(hào)。綜上所述，gcMBL基因在草魚抗細(xì)菌侵染中起到重要的免疫作用。
　　3.草魚甘露糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶1的免疫功能的研究
　　露糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶（MASPs）是補(bǔ)體系統(tǒng)凝集素途徑的重要組分，本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中得到的草魚 MASP-1（gcMASP-1）序列進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)gcMASP-1基因的cDNA全長3308 bp，ORF全長為2160 bp，編碼719個(gè)氨基酸，gcMASP-1在

6、各物種間保守程度較高。組織表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，gcMASP-1基因廣泛分布在各個(gè)組織中，相對(duì)較高的在心臟、肝臟和腦組織中表達(dá)。利用AH10侵染草魚，發(fā)現(xiàn)gcMASP-1的表達(dá)量呈波動(dòng)性變化；利用AH10、LPS和FLA刺激草魚肝臟原代細(xì)胞，結(jié)果表明gcMASP-1的表達(dá)量隨刺激時(shí)間的變化呈波動(dòng)變化。在草魚肝細(xì)胞中過表達(dá) gcMASP-1后，凝集素通路上游基因的表達(dá)量沒有顯著變化；但下游基因除C5外的表達(dá)水平均顯著提高；同時(shí)，也可以誘導(dǎo)免

7、疫相關(guān)基因gcil-1β，gcIFN和gcTNF-α的表達(dá)。利用AH10刺激過表達(dá)或抑制表達(dá)gcMASP-1的細(xì)胞，結(jié)果表明，過表達(dá)細(xì)胞中炎癥因子等的表達(dá)量均顯著上調(diào)；在敲減細(xì)胞中，上述因子等表達(dá)量被顯著抑制。綜上所述，gcMASP-1在草魚凝集素途徑中起到關(guān)鍵的抗菌免疫功能。
　　4.草魚補(bǔ)體C2在抗菌侵疫功中的作用和功能
　　補(bǔ)體C2是凝集素途徑中形成C3轉(zhuǎn)化酶的重要組分。草魚C2（gcC2）的cDNA全長為2684 b

8、p，包含2523 bp的ORF，編碼840個(gè)氨基酸，蛋白序列在物種間保守。gcC2的mRNA在草魚各組織中均有表達(dá)。AH10能在草魚體內(nèi)和體外影響gcC2的表達(dá)量。同時(shí)，LPS和FLA能引起肝臟原代細(xì)胞中g(shù)cC2表達(dá)量的改變。在肝臟原代細(xì)胞中過表達(dá)gcC2能引起除C5外的補(bǔ)體系統(tǒng)下游組分表達(dá)量升高。利用AH10、LPS或FLA刺激過表達(dá)或敲減gcC2的肝臟細(xì)胞，結(jié)果顯示，在過表達(dá)細(xì)胞中炎癥因子等的表達(dá)量顯著提高；在敲減細(xì)胞中被顯著抑制。