蒙古冰草MwLEA3基因功能研究及MwRRT基因的克隆.pdf

1、蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）是禾本科冰草屬小麥族多年生草本植物，不僅具有極高的飼用價(jià)值，而且具有很強(qiáng)的抗逆性，富含大量的抗旱、抗寒、耐鹽基因，可以為牧草及近緣種作物（水稻、小麥、玉米等）的抗性改良及新品種選育提供寶貴的資源。本研究分離出蒙古冰草MwLEA3基因并進(jìn)行了功能驗(yàn)證，并首次克隆得到了蒙古冰草類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。主要研究結(jié)果如下：
　　1.分離了蒙古冰草MwLEA3基因，其全長(zhǎng)為705bp，開

2、放閱讀框?yàn)?92bp，編碼163個(gè)氨基酸。
　　2.構(gòu)建了蒙古冰草 MwLEA3基因的亞細(xì)胞定位融合蛋白載體 pA7-MwLEA3，并將此載體及 pA7-GFP載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至洋蔥細(xì)胞中進(jìn)行亞細(xì)胞定位。試驗(yàn)結(jié)果表明，pA7-MwLEA3融合蛋白集中分布在細(xì)胞核中，而對(duì)照pA7-GFP在整個(gè)細(xì)胞中均有分布，證明了MwLEA3基因表達(dá)的蛋白是核定位蛋白。
　　3.成功構(gòu)建蒙古冰草MwLEA3基因植物表達(dá)載體pCAM-MwLEA3，

3、并經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。對(duì)經(jīng)過抗性檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因煙草 T0代植株進(jìn)行 PCR檢測(cè)、PCR-Southern、RT-PCR鑒定以及干旱脅迫試驗(yàn)。分子檢測(cè)結(jié)果表明，MwLEA3基因已整合到煙草基因組中，并在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá)；干旱脅迫試驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗旱性高于野生型煙草植株。
　　4.對(duì)10個(gè)株系轉(zhuǎn)基因煙草T1代的卡那霉素抗性進(jìn)行研究表明，10個(gè)株系中，有7個(gè)株系的T1代的分離比例為3:l，符合孟德爾式遺傳規(guī)律，這表

4、明MwLEA3基因是單拷貝插入；另外3個(gè)株系的T1代不符合孟德爾式3:1的遺傳規(guī)律，說明這些植株中的MwLEA3基因可能是多個(gè)拷貝插入的。
　　5.構(gòu)建了35S啟動(dòng)子調(diào)控的具有MwLEA3基因反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的ihpRNA表達(dá)載體pART27-MwLEA3(HB)-MwLEA3(EX)，并通過凍融法轉(zhuǎn)化將MwLEA3基因的ihpRNA表達(dá)框架成功導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。利用帶有目的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液侵染蒙古冰草愈傷組織，現(xiàn)正

5、在篩選分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，后續(xù)試驗(yàn)正在進(jìn)行中。
　　6.首次克隆得到了蒙古冰草類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（MwRRT）基因，該基因片段長(zhǎng)度為1005bp，在1～225bp為非編碼區(qū)，長(zhǎng)度為225bp，其氨基酸序列在226～1005bp，共780bp，編碼260個(gè)氨基酸。核苷酸及氨基酸同源性對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，所克隆基因與小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）、大麥（Hordeum vulgare）、高粱（Sorg