vegf的神經(jīng)保護機制之一——誘導kv1.2鉀通道蛋白的磷酸化

1、復旦大學博士學位論文VEGF的神經(jīng)保護機制之一——誘導Kv1.2鉀通道蛋白的磷酸化姓名：邱梅紅申請學位級別：博士專業(yè)：神經(jīng)生物學指導教師：孫鳳艷20030506! 燮蘭堡主蘭竺堡壅 V E G F 的神經(jīng)保護機制之一——誘導K v l ．2 鉀通道蛋白的磷酸化中文摘要：V E G F 的神經(jīng)保護機制之一——誘導K v l ．2 鉀通道蛋白的磷酸化以往的研究結果顯示血管內皮生長因子( v a s c u l a r e n d o t h

2、 e l i a lg r o w t h f a c t o r ，V E G F ) 具有直接的神經(jīng)營養(yǎng)及神經(jīng)細胞保護效應，并能抑制神經(jīng)元的外向延遲整流鉀電流( o u t w a r d d e l a y e d —r e c t i f i e rp o t a s s i u mc u r r e n t ，糸) 。矗在缺血神經(jīng)元中是增強的，介導k 的鉀通道的過度激活與缺血再灌腦損傷中的延遲性神經(jīng)元死亡相關，因此抑制k 可能

3、是V E G F 的缺血神經(jīng)保護作用機制之一。在介導奴的鉀通道家族中，K v l ．2 是其中的一個亞型，研究報道它在缺血神經(jīng)元中的表達是增高的；此外，它的活性與其酪氨酸磷酸化水平相關，在其氨基末端的酪氨酸殘基經(jīng)酪氨酸激酶磷酸化后可顯著降低其介導的電流的幅度。由此我們推測V E G F 可能通過增加K v l ．2 的磷酸化水平，從而抑制缺血神經(jīng)元的k ，部分實現(xiàn)其缺血神經(jīng)細胞保護作用。為了驗證上述假設，本文分別在整體和離體水平，采用大

4、腦中動脈缺血( m i d d l e c e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n ，M C A o ) 和體外氧一糖剝奪( h y p o x i a a n dg l u c o s e —d e p d v a t i o n ，H G D ) 缺血模型，首先了解了K v l ．2蛋白的細胞定位及與V E G F 受體F l k ．1 和F i t ．1 的共存情況，觀察了整體M C A

5、 o后缺血再灌不同時間大鼠腦內K v l ．2 蛋白的磷酸化水平變化，然后通過外源性給予V E G F 蛋白，在S H ．S Y 5 Y 細胞株上觀察其對缺血細胞存活率及K v l ．2 蛋白磷酸化水平的影響，最后利用V E G F 反義脫氧寡核苷酸( o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e ，0 D N ) 特異阻斷內源性V E G F 蛋白的表達，觀察內源性V E G F 蛋白在缺血細胞損傷及

6、調節(jié)K v l ．2 蛋白磷酸化中的作用，以進一步明確V E G F 缺血保護效應與其調節(jié)K v l ．2 蛋白磷酸化之間的關系。現(xiàn)將實驗結果概述如下：1 ． 大鼠腦內K v l ．2 蛋白的細胞定位及其與V E G F 受體間的共存關系大鼠大腦皮層K v l ．2 、N S E 、G F A P 免疫熒光三標結果：K v l ．2 蛋白分布在細胞膜上，大部分K v l ．2 免疫陽性細胞表達有N S E ，只有在少量K v l ．2

7、陽性細胞上表達有G F A P 。結果表明K v l ．2 主要表達在神經(jīng)元上。在大鼠大腦皮層，K v l ．2 與F l k ．1 ／F i t ．1 的免疫熒光雙標結果顯示，許多細胞表達有F l k 一1 受體，它們中大部分呈K Ⅳ1 ．2 蛋白免疫陽性。并且這些雙標的細胞在形態(tài)上明顯呈神經(jīng)元樣。而在腦片上很少見到F l t - i 一免疫陽性細胞，且未見到有K v l ．2 與F l t - 1 雙標的細胞。在大鼠海馬C A l