普魯蘭短梗霉HN2-3脂肪酶的生產、分離純化、基因克隆和表達的研究.pdf

1、從鹽場分離到一株高產脂肪酶的酵母菌HN2-3，經酵母常規(guī)鑒定方法和分子生物學方法鑒定為普魯蘭短梗霉。該酵母生產脂肪酶最佳培養(yǎng)基組分為3.0％(w/v)橄欖油、0.4％(w/v)葡萄糖、0.6％(w/v)硫酸銨、0.1％(w/v)K2HPO4和0.05％(w/v)MgSO4.7H2O，最佳培養(yǎng)條件為初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度25℃和轉速170rpm。我們發(fā)現(xiàn)橄欖油的添加時間對于脂肪酶的生產具有很大的影響，在接種培養(yǎng)6h后加入橄欖油，繼續(xù)培

2、養(yǎng)96h，脂肪酶產量達到最大，酶活力達到8.0 U/ml。 普魯蘭短梗霉HN2-3胞外脂肪酶通過硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析和陰離子交換層析得到純化，純化倍數(shù)為3.4。SDS-PAGE顯示該脂肪酶分子量約為63.5 kDa。純化酶的最適作用pH和最適作用溫度分別為8.5和35℃，該酶被Hg2+ Fe2+和Zn2+強烈抑制。同時苯甲基磺酰氟可以強烈抑制該脂肪酶的活性。乙二胺四乙酸對該純化酶的影響不大，碘乙酸可以微弱抑制該酶的活性。純

3、化的脂肪酶對于花生油具有較強的水解活性。 利用RACE的方法克隆了普魯蘭短梗霉HN2-3胞外脂肪酶的基因。該基因含有一個1245bp的ORF框，同時發(fā)現(xiàn)從基因組克隆得到的脂肪酶基因序列中含有一個55bp的內含子。該基因編碼一個414個氨基酸殘基的蛋白質，在氨基端含有一個26個氨基酸殘基的信號肽。推導氨基酸序列含有脂肪酶的保守序列(G-X-S-X-G)和3個推測的N-糖基化位點。通過脂肪酶系統(tǒng)進化樹分析，普魯，蘭短梗霉HN2-3

4、脂肪酶與Aspergillus fumigatus(XP_750543)和Neosartorya fischeri(XP 001257768)脂肪酶親緣關系最近，同源性分別為50％和51％。 將脂肪酶基因克隆到pET-24a(+)表達載體上，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進行了表達。SDS-PAGE和免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白的分子量約為47kDa。測定了陽性克隆BL21(DE3)/pET-24a(+)LIP1細胞裂解液的脂肪