普魯蘭短梗霉HN2-3菌株堿性蛋白酶的純化、基因克隆、表達(dá)、表面展示及生產(chǎn)活性肽的應(yīng)用研究.pdf

1、從分離自海水、海泥及海洋生物內(nèi)臟及海生植物表面的400余株酵母菌中分離到5株產(chǎn)蛋白酶的海洋酵母，能在酪蛋白雙層平板上形成明顯的透明圈，它們分別是HN2-3，N13d，N13C，Mb5和HN3-2。通過(guò)酵母鑒定的常規(guī)方法并結(jié)合分子生物學(xué)方法，鑒定出HN2-3，N13d，N13C與HN3-24株菌屬于普魯蘭短梗霉(Aureobasidium pullulans)，Mb5菌株屬于解脂亞羅酵母(Yarrowia lipolytica)。來(lái)自菌株

2、HN2-3所產(chǎn)蛋白酶酶活性及酶解活性肽產(chǎn)物的ACE(AngiotensinI-converting enzyme)抑制活性最高。來(lái)自菌株HN2-3的蛋白酶命名為ALP2。 利用層析柱Sephadex G-75與陰離子交換柱DEAE Sepharose Fast Flow純化了菌株HN2-3的胞外堿性蛋白酶ALP2，純化2.34倍。通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳，得到的ALP2蛋白條帶分子量為33.0kDa，最適作用溫度為52℃。

3、Mn2+、Mg2+和Na+離子濃度在5 mM時(shí)對(duì)純化蛋白酶酶活有激活作用， Zn2+、Ca2+、K+和Li+對(duì)酶活的影響不大；而當(dāng)存在Fe2+、Fe3+、Cu2+、Co2+、Ag+、和Hg2+離子時(shí)，蛋白酶活明顯降低。苯甲基磺酰氟(PMSF)強(qiáng)烈抑制蛋白ALP2的活性，乙二胺四乙酸(EDTA)與碘乙酸微弱抑制蛋白酶的活性。利用純化的酶酶解礪蝦蛋白，螺旋藻蛋白(Arthospira platensis)，酵母N3C(Yarrowia li

4、olytica)和YA03a(Hansenia sporauvarum)蛋白，來(lái)自蠣蝦蛋白的水解物ACE抑制活性與抗氧化活性最高，分別達(dá)到88.3％與47.3％。這說(shuō)明純化的ALP2蛋白酶在食品和醫(yī)藥方面具有良好的前景。 利用簡(jiǎn)并PCR、反向PCR與RT-PCR獲得了蛋白酶ALP2基因的DNA序列與eDNA序列?；駻LP2的DNA序列為1354 bD，在NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的登

5、陸號(hào)為EU331441。ALP2基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)1248 bp，在NCBI上的登陸號(hào)為EU224431，編碼415個(gè)氨基酸，推導(dǎo)分子量為42.9 kDa?；駻LP2具有兩個(gè)內(nèi)含子，分別為54bp和52 bp。通過(guò)分子生物學(xué)軟件分析，基因ALP2前18個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，此基因編碼的蛋白具有絲氨酸活性位點(diǎn)與組氨酸活性位點(diǎn)，等電點(diǎn)為6.44。利用質(zhì)粒pINAl317對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子能在牛奶-PPB雙層平板上形成明

6、顯的透明圈。轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵上清液的蛋白酶活性也進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果說(shuō)明克隆到的基因ALP2確實(shí)為蛋白酶基因，而且能在Y.lipolytica中進(jìn)行表達(dá)，并分泌到細(xì)胞外。利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的表面展示質(zhì)粒pINA1317-YICPW110對(duì)蛋白酶基因ALP2進(jìn)行了表面展示，轉(zhuǎn)化子能在牛奶雙層平板上形成明顯的透明圈。表面展示的蛋白酶酶解不同的蛋白源能夠產(chǎn)生活性肽，發(fā)現(xiàn)酶解金黃色隱球酵母G7a(Cryptococcus aureus)的細(xì)胞蛋白所產(chǎn)活性