呋喃西林代謝物酶免疫分析方法的研究.pdf

1、硝基呋喃類獸藥是一類人工合成的廣譜抗菌藥，用于預(yù)防和治療由大腸桿菌和沙門氏菌引起的胃腸道感染，這類藥物進(jìn)入動(dòng)物體后會(huì)很快代謝為相應(yīng)的代謝物，并在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定存在。由于該類藥物及其代謝物會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生潛在的致癌、致突變作用，很多國家禁止用于食品生產(chǎn)的動(dòng)物使用此類藥物。但是此類抗生素成本低、預(yù)防和治療細(xì)菌感染效果明顯，因此仍然被非法使用。呋喃西林是硝基呋喃類獸藥中的一種。目前檢測(cè)呋喃西林代謝物（SEM）的方法主要是儀器分析法，這類方法雖然

2、準(zhǔn)確度和精密度高、重復(fù)性好，且可同時(shí)檢測(cè)多種物質(zhì)，但是檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本高、操作技術(shù)要求高，不適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及大量樣品的篩查。與之相比，酶免疫分析法則技術(shù)要求不高，可實(shí)現(xiàn)大批量樣品的快速篩查，且其準(zhǔn)確度和精密度均較高、特異性較強(qiáng)。因此，本研究建立了三種檢測(cè)SEM的酶免疫分析法，包括化學(xué)發(fā)光酶免疫法（CLEIA）、生物素-親和素放大酶免疫法（BA-ELISA）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。
　　首先，分別用對(duì)醛基苯甲酸（4-CBA

3、）和鄰硝基苯甲醛（2-NPA）對(duì)SEM進(jìn)行衍生，合成了半抗原CPSEM和目標(biāo)檢測(cè)物NPSEM，并用紅外光譜和核磁共振對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。采用活化酯法將CPSEM與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)制備獲得了人工抗原CPSEM-OVA，并用紫外掃譜法進(jìn)行了鑒定。
　　其次，對(duì)酶免疫分析操作中的主要影響條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化得到的化學(xué)發(fā)光液配方為：A液為8mM對(duì)碘苯酚溶液和10mM魯米諾溶液按體積比1:1混勻，B液為每10mL Tris-HCl緩沖溶

4、液中加5μL30％H2O2溶液；臨用前將A液和B液按體積比1:1混勻。CLEIA最佳反應(yīng)條件為包被原800倍稀釋，單抗800倍稀釋，封閉液為1%脫脂乳，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)30min，HRP-IgG孵育60min。BA-ELISA最佳反應(yīng)條件為包被原800倍稀釋，單抗12800倍稀釋，SA-HRP8000倍稀釋，封閉液為1%脫脂乳，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)30min，Biotin-IgG孵育30min，SA-HRP孵育60min，顯色15min。ELISA最佳反應(yīng)

5、條件為包被原800倍稀釋，單抗6400倍稀釋，封閉液為0.5%脫脂乳，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)30min，HRP-IgG孵育30min，顯色15min。
　　最后，在已優(yōu)化的最優(yōu)條件下對(duì)建立的3種酶免疫分析方法進(jìn)行了對(duì)比評(píng)價(jià)。3種方法與其他結(jié)構(gòu)類似物以及所用衍生化試劑的交叉反應(yīng)率（cross reactivity, CR）均小于0.1%。CLEIA線性方程為y=-0.4654x+0.3768（R2=0.993），IC50為0.544ng/mL，線

6、性范圍為0.123~2.398ng/mL；批內(nèi)和批間變異系數(shù)（Coefficient of Variation, CV）分別為1.9%~4.1%和2.8%~5.3%；回收率為89.6%~98.0%， CV為3.0%~9.5%。BA-ELISA線性方程為y=-0.3299+0.4272（R2=0.990），IC50為0.601ng/mL，線性范圍為0.074~4.883ng/mL；批內(nèi)和批間CV分別為1.2%~3.6%和2.5%~5.1%

7、；回收率為88.8%~98.5%， CV為3.7%~5.6%。ELISA線性方程為y=-0.4262x+0.6926， IC50為2.831ng/mL，線性范圍為0.560~14.315ng/mL；批內(nèi)和批間CV分別為1.8%~5.1%和3.4%~6.3%；回收率為87.9%~94.1%，CV為4.2%~8.9%。
　　結(jié)果表明，本研究建立的檢測(cè)SEM殘留的三種方法雖然在靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度方面存在一定差異，各有優(yōu)缺點(diǎn)，準(zhǔn)確度方