抗呋喃西林代謝物衍生物單克隆抗體的研制及其ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、呋喃西林(Nitrofural)是硝基呋喃類藥物的一種。由于它以及其代謝物均具有很強(qiáng)的毒性和致癌副作用，已引起世界各國(guó)的高度重視。呋喃類物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定性較差，而其代謝物與組織蛋白結(jié)合可以形成穩(wěn)定的化合物，現(xiàn)在各國(guó)均禁止其在畜牧生產(chǎn)上應(yīng)用，故對(duì)于呋喃類物質(zhì)代謝物的研究和檢測(cè)的意義就顯得更為重要。 目前呋喃西林代謝物的檢測(cè)技術(shù)主要有色譜技術(shù)和免疫分析技術(shù)。色譜技術(shù)樣品處理繁瑣費(fèi)時(shí)，成本高，而且需要有經(jīng)過專門訓(xùn)練的專業(yè)人員來操作復(fù)

2、雜的儀器設(shè)備，不適合大批量樣品的篩選。作為一種快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定正逐漸應(yīng)用于藥物的殘留檢測(cè)。本研究通過衍生化抗原的合成和單克隆抗體技術(shù)，建立了能分泌呋喃西林代謝物衍生物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并用單克隆抗體建立了檢測(cè)呋喃西林代謝物殘留的ELISA方法。 首先將呋喃西林代謝物氨基脲(SEM)與對(duì)羧基苯甲醛(CBA)進(jìn)行衍生化反應(yīng)，使前者的氨基和后者的醛基發(fā)生共價(jià)反應(yīng)生成弱堿Schiff堿，進(jìn)而生成SEM

3、衍生物(CPSEM)，通過紅外掃描氨基特征吸收峰鑒定衍生物。然后將CPSEM與載體蛋白BSA反應(yīng)，用活性酯法使前者的羧基和后者的氨基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)生成酰胺鍵，從而實(shí)現(xiàn)了半抗原與載體蛋白的偶連，通過紫外掃描280nm蛋白特征吸收峰鑒定偶連物。 用合成的CPSEM人工抗原免疫Balb/c小鼠，并取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法篩選，最終獲得了3株能分泌抗呋喃西林代謝物衍生化抗原(CP

4、SEM)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。特異性試驗(yàn)證明單抗有很強(qiáng)的特異性，僅與試驗(yàn)的CPSEM，而不與CPAOZ、CPAHD、CBA，SEM等反應(yīng)。 用同樣的方法將CPSEM與卵清蛋白偶連，將其作為包被抗原(CPSEM-OVA)，包被酶標(biāo)板，CPSEM為競(jìng)爭(zhēng)的半抗原，然后和待檢樣品與定量的抗CPSEM單克隆抗體反應(yīng)，通過酶標(biāo)抗體作用和底物顯色，建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，競(jìng)爭(zhēng)ELISA最佳包被抗原濃度為8μg/ml