呋喃它酮代謝物可視化快速免疫檢測方法研究.pdf

1、分類號：TS2016密級：(秘密、機(jī)密、絕密)學(xué)校代碼：10057研究生學(xué)號：2011813031呋喃它酮代謝物可視化快速免疫檢測方法研究StudyoftheVisualandRapidImmunosorbentMethodsfortheDetectionofFuraltadoneMetabolites專業(yè)名稱：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)指導(dǎo)教師姓名：王俊平教授研究生姓名：朱冰申請學(xué)位級別：醫(yī)學(xué)碩士論文提交日期：2014年3月論文課題來源：國家科

2、技項(xiàng)目學(xué)位授予單位：天津科技大學(xué)摘要本論文建立了呋哺它酮代謝物AMOZ的膠體金免疫層析試紙條和免疫親和凝膠柱分析方法，并用于動(dòng)物源性食品中呋喃它酮代謝物殘留的可視化快速檢測。呋喃它酮代謝物AMOZ特異性抗血清(免疫原為CPAMOZBSA)采用ProteinA—Sepharose4B免疫親合層析法純化，得到呋喃它酮代謝物AMOZ的特異性多克隆抗體，戊二醛法合成包被抗原(AMOZOVA)。檸檬酸三鈉還原法制備17、20、25nnl的膠體金粒

3、子，經(jīng)優(yōu)化選擇17nm的膠體金標(biāo)記抗體。并優(yōu)化膠體金免疫層析試紙條的層析條件，抗原、羊抗兔二抗、金標(biāo)抗體分別稀釋5、65、10倍稀釋，硝酸纖維素膜選用型號是Millipore135s，抗原稀釋液為磷酸鹽緩沖溶液(pH74)，包被條件是37oC30min。以最優(yōu)層析條件組裝呋喃它酮代謝物膠體金免疫層析試紙條，建立呋喃它酮代謝物免疫層析試紙條分析方法，對NPAMOZ標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限為3∥L。該分析方法具有很好的特異性，除對呋喃它酮原藥有交叉反

4、應(yīng)外，與其他硝基呋喃類藥物及其代謝物及其他8種常用獸藥均無交叉。選取牛肉、鯛魚、雞肉、蝦肉、豬肉、魷魚、雞肝、黃花魚作為檢測樣品，添加AMOZ標(biāo)準(zhǔn)品，用快速衍生化方法(60oC水浴下衍生反應(yīng)120min)轉(zhuǎn)化成NPAMOZ，對樣品進(jìn)行處理后用所建立的膠體金免疫層析試紙條方法檢測，對樣品中AMOZ的檢出限為05pg／kg。活化酯法制各酶標(biāo)抗原(CPAMOZ—HRP)，用溴化氫活化的瓊脂糖凝膠與呋喃它酮代謝物抗體和HRP多克隆抗體偶聯(lián)，分別

5、制得抗體膠和HRP抗體膠。把溴化氫活化的瓊脂糖凝膠封閉處理后制成封閉膠。并對免疫親和凝膠檢測柱工作條件進(jìn)行了優(yōu)化，抗體膠、酶標(biāo)抗原、HRP抗體膠的稀釋倍數(shù)分別為80150000、20倍，工作液pH74，加樣時(shí)間是lmin，顯色時(shí)間為3～4min。以最優(yōu)的工作條件建立呋喃它酮代謝物免疫親和凝膠檢測柱分析方法，本方法對NPAMOZ標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限為20肛嘰。建立的免疫親和凝膠檢測柱分析方法具有很好的特異性，除對呋喃它酮原藥有交叉反應(yīng)外，與其他

6、硝基呋喃類藥物及其代謝物均沒有交叉。選取8種動(dòng)物源性產(chǎn)品作為檢測樣品，添加AMOZ標(biāo)準(zhǔn)品，運(yùn)用快速衍生方法對樣品進(jìn)行處理后應(yīng)用所建立的免疫親和凝膠檢測柱方法檢測，對樣品中AMOZ的檢出限為3pg／kg。本實(shí)驗(yàn)建立了兩種快速可視化檢測呋喃它酮代謝物的分析方法，與酶聯(lián)免疫分析方法的一致性較好，驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性。并且檢測步驟簡單，目測即可得出結(jié)果，無需借助儀器，整個(gè)檢測時(shí)間不超過10min，適用于大量樣品的快速篩選，具有很好的發(fā)展前景。關(guān)鍵