呋喃它酮代謝物酶免疫分析方法的研究.pdf

1、獸藥能促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)、改善畜產(chǎn)品的肉質(zhì)與口感、增加飼料利用率、減少動(dòng)物的發(fā)病率、增加存活率，在現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中有不可或缺的地位。但實(shí)際生產(chǎn)中，誤用、濫用獸藥，導(dǎo)致畜牧產(chǎn)品中獸藥殘留超標(biāo)，經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體后，易蓄積毒性、產(chǎn)生耐藥性等、嚴(yán)重時(shí)威脅人體健康。呋喃它酮屬于硝基呋喃類藥物，半衰期只有幾個(gè)小時(shí)，在體內(nèi)會(huì)被迅速代謝為3-氨基-5-嗎琳代甲基-2-惡唑烷酮（AMOZ）能夠穩(wěn)定存在，目前建立的檢測(cè)呋喃它酮代謝物常用的方法是儀器分析法，這些檢

2、測(cè)法靈敏度高特異性強(qiáng)，但儀器昂貴、操作復(fù)雜、需要專業(yè)的人員進(jìn)行操作并耗時(shí)不能夠普及。本研究建立的檢測(cè)AMOZ酶免疫吸附法（ELISA）、生物素-親和素放大酶免疫分析法（BA-ELISA）與化學(xué)發(fā)光酶免疫法（CLEIA）是基于抗原抗體特異性反應(yīng)的酶免疫分析法，與儀器分析法比較該方法操作簡(jiǎn)便、儀器簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快、成本低，能夠?qū)悠愤M(jìn)行批量的快速篩查。
　　首先，將AMOZ與對(duì)醛基苯甲酸（4-CBA）衍生化反應(yīng)合成CPAMOZ，用核磁

3、共振與紅外光譜對(duì)合成的物質(zhì)鑒定。CPAMOZ與卵清蛋白（OVA）通過(guò)活化酯法偶聯(lián)得到人工抗原CPAMOZ-OVA，并通過(guò)紫外掃譜進(jìn)行鑒定。
　　其次，對(duì)影響酶免疫法的主要因素優(yōu)化。ELISA法最優(yōu)工作濃度：包被原稀釋倍數(shù)與單克隆抗體稀釋倍數(shù)分別為500與2000，2％脫脂乳為封閉液，競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗（HRP-IgG）孵育時(shí)間都為30 min，顯色15 min。CLEIA法化學(xué)發(fā)光液的最優(yōu)工作濃度為：對(duì)碘苯酚溶

4、液與魯米諾溶液按濃度分別為6 mmol/L與10 mmol/L按等體積比混合為化學(xué)發(fā)光A液，4μL30%H2O2溶液滴入10 mL Tris-HCl中為B液；臨用前將A液與B液等體積比混合使用。CLEIA最優(yōu)工作濃度：包被原與單克隆抗體稀釋倍數(shù)均為4000，2%脫脂乳作為封閉液，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)與二抗孵育時(shí)間均為30 min。BA-ELISA法最優(yōu)工作濃度：包被原與單克隆抗體稀釋倍數(shù)分別為1000與2000，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（SA

5、-HRP）稀釋倍數(shù)為8000，封閉液為2%脫脂乳，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)與SA-HRP孵育時(shí)間均為30 min，生物素標(biāo)記羊抗鼠二抗(Biotin-IgG)孵育時(shí)間為60 min，顯色時(shí)間為15 min。
　　最后，3種酶免疫法在靈敏度、特異性、精密度和準(zhǔn)確度4個(gè)方面進(jìn)行方法評(píng)價(jià)。ELISA線性方程為y=-0.439x+0.670（R2=0.992），IC50為2.439 ng/mL，線性范圍為0.506~11.765 ng/mL；批內(nèi)變異系數(shù)

6、（CV）和批間CV分別為1.4%~5.8%和2.1%~4.9%；回收率為86.7%~90.1%，CV為4.8%~7.3%。CLEIA線性方程為y=-0.493x+0.471（R2=0.995），IC50為0.873 ng/mL，線性范圍為0.215~3.545 ng/mL；批內(nèi)和批間CV分別為1.5%~4.3%和1.2%~5.2%；回收率為88.9%~94.2%， CV為4.2%~6.3%。BA-ELISA線性方程為y=-0.442x+

7、0.483(R2=0.999)，IC50為0.915 ng/mL，線性范圍為0.192~4.367 ng/mL；批內(nèi)和批間 CV分別為1.3%~4.2%和1.1%~5.6%；回收率為92.5%~94.6%，CV為4.4%~9.6%。高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）回收率為98.7%~99.8%，CV為1.1%~2.6%。建立的3種檢測(cè)AMOZ酶免疫分析法與其代謝物以及衍生物均沒(méi)有交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率（CR）均小于0.1%