麝香草酚誘導(dǎo)黃曲霉孢子死亡機(jī)制的探究.pdf

1、黃曲霉（Aspergillus flavus）作為一種腐生絲狀致病真菌，常見于發(fā)霉的糧食和豆類和堅(jiān)果表面，其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素（aflatoxins）對(duì)人類和動(dòng)物的肝臟具有很強(qiáng)的致癌性能夠?qū)е缕淇焖偎劳?。一些抗菌劑（伏立康唑）常用于治療黃曲霉的感染。然而，最近研究表明黃曲霉對(duì)唑類藥物產(chǎn)生耐藥性從而導(dǎo)致臨床治療真菌感染的失敗。因此，深層次地了解黃曲霉的死亡機(jī)制有助于新的殺菌藥物研發(fā)。麝香草酚（Thymol），主要存在于唇形科百里

2、香屬植物中，是百里香屬植物精油的主要成分。研究表明麝香草酚可以有效抑制細(xì)菌、霉菌和酵母的生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)麝香草酚能夠誘導(dǎo)黃曲霉孢子的裂解死亡，為了進(jìn)一步探究其作用機(jī)理，本文深度研究了麝香草酚誘導(dǎo)黃曲霉孢子的死亡方式以及可能的作用靶標(biāo)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴麝香草酚對(duì)黃曲霉表現(xiàn)出了高效的抑菌效應(yīng)：當(dāng)濃度大于80μg/ml幾乎完全抑制黃曲霉孢子的生長(zhǎng)。通過孢子活力分析發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理導(dǎo)致超過99.9%的黃曲霉孢子死亡。掃描電鏡結(jié)

3、果顯示麝香草酚能夠?qū)е曼S曲霉孢子發(fā)生裂解。 ROS和NO作為細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子，經(jīng)常被報(bào)道與細(xì)胞的死亡相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度的麝香草酚可以誘導(dǎo)黃曲霉孢子產(chǎn)生大量的ROS和NO，而且ROS和NO產(chǎn)生的抑制劑均可以顯著降低麝香草酚的這種殺菌效應(yīng)。ROS抑制劑還可以抑制NO產(chǎn)生。由此可見ROS可能通過誘導(dǎo)NO產(chǎn)生，參與麝香草酚對(duì)黃曲霉孢子的致死作用。⑵真核細(xì)胞的死亡方式包含多種，總的來講包含細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。通過Hoechst33342和PI

4、雙染，我們采用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡對(duì)麝香草酚處理后黃曲霉孢子的早期生理活動(dòng)進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明麝香草酚處理3h孢子就開始發(fā)生凋亡；并且隨著時(shí)間延長(zhǎng)凋亡比例顯著增加，在處理6h后大部分孢子已處于凋亡狀態(tài)。通過Tunnel染色發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理9h后黃曲霉孢子出現(xiàn)了凋亡的另外一個(gè)特征：DNA斷裂現(xiàn)象；通過 JC-1熒光探針標(biāo)記，我們發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理導(dǎo)致線粒體的膜電位減弱，這說明線粒體膜可能受到了損傷。真核生物線粒體損傷會(huì)釋放細(xì)胞色素c到細(xì)胞

5、質(zhì)中并激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase），啟動(dòng)細(xì)胞凋亡通過caspase9檢測(cè)試劑盒，我們發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理后黃曲霉孢子中caspase9的活性急劇增加通過使用不可逆的 Caspase廣譜抑制劑氟甲基酮（Z-VAD-FMK）抑制 Caspase的活性，發(fā)現(xiàn)caspase9的活性受到顯著抑制，而且發(fā)生細(xì)胞凋亡的孢子數(shù)量明顯減少。這就進(jìn)一步表明麝香草酚可能誘導(dǎo)黃曲霉孢子線粒體損傷最終導(dǎo)致了凋亡發(fā)生。⑶為了進(jìn)一步探索麝香草酚誘

6、導(dǎo)黃曲霉孢子細(xì)胞凋亡的潛在靶標(biāo)，在人體蛋白-藥物互作數(shù)據(jù)庫(kù)DRAR-CPI中檢索能夠與麝香草酚進(jìn)行分子互作的蛋白。從中發(fā)現(xiàn)人體中電壓門控鉀離子通道蛋白（PDB id:1ZSX）可以與麝香草酚誘互作，而且與黃曲霉中的KCNAB具有較高的同源性。電壓門控鉀離子通道蛋白經(jīng)常被報(bào)道與細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)有關(guān)。隨后我們通過同源建模構(gòu)建了KCNAB的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過模擬分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)麝香草酚與黃曲霉的KCNAB的互作，發(fā)現(xiàn)其作用方式跟其與人體1ZSX中的作

7、用方式類似。通過 K+熒光探針 PBFI標(biāo)記,我們發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理導(dǎo)致孢子內(nèi)鉀離子濃度瞬間升高；當(dāng)外源添加電壓門控鉀離子通道抑制劑（4-氨基吡啶）時(shí)可以抑制鉀離子濃度的增高，而且同時(shí)顯著降低了凋亡的孢子數(shù)量。這些結(jié)果有力支持了生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果：麝香草酚可以與KCNAB互作，其結(jié)果促進(jìn)黃曲霉孢子細(xì)胞凋亡。⑷鑒于KCNAB在麝香草酚誘導(dǎo)黃曲霉孢子細(xì)胞凋亡中的作用，我們研究了KCNAB在黃曲霉的一些生理功能。我們使用黃曲霉CA14Δpyr

8、G ku70作為母本菌株構(gòu)建了缺失突變體ΔKCNAB。結(jié)果顯示KCNAB缺失導(dǎo)致黃曲霉孢子萌發(fā)紊亂：在蒸餾水中萌發(fā)而在培養(yǎng)中萌發(fā)受阻。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)缺失突變體對(duì)洋蔥表皮和花生的侵染力顯著降低。這很可能是由于KCNAB作為電壓門控鉀離子通道β亞基其缺失會(huì)導(dǎo)致通道對(duì)外界刺激過度反應(yīng)。使用麝香草酚處理突變體，發(fā)現(xiàn)突變體的 K+激發(fā)現(xiàn)象更加明顯，而且凋亡現(xiàn)象更加顯著。這不僅證實(shí)了我們關(guān)于通道過度反應(yīng)的猜想，而且進(jìn)一步支持了電壓門控鉀離子通道蛋白