黃腐酚體外抗腫瘤活性及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和意義：
　　黃腐酚(Xanthohumol,XN）是一種啤酒花中特有的多酚黃酮物質(zhì)，長久以來，啤酒花作為啤酒釀造業(yè)中的添加劑賦予啤酒特殊的苦味。近年來黃腐酚因其廣泛的生物學(xué)功能和在預(yù)防與治療癌癥中的作用而備受關(guān)注。資料顯示，黃腐酚有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長增殖，包括前列腺癌、纖維肉瘤、白血病、結(jié)腸癌、乳腺癌和卵巢癌等，然而其作用機(jī)制尚不明確。因此，本文以人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60和大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞NG108-15

2、為主要體外細(xì)胞模型，觀察并評價(jià)黃腐酚對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞自噬以及細(xì)胞副凋亡等方面的影響，深入探討該化合物的抗癌機(jī)制，為黃腐酚開發(fā)成功能保健食品及其臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　采用臺盼藍(lán)排染法檢測不同濃度黃腐酚對細(xì)胞增殖的影響；光學(xué)顯微鏡下觀察不同濃度黃腐酚處理細(xì)胞后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；采用Annexin V/PI雙染法和免疫熒光法檢測黃腐酚處理后的細(xì)胞凋亡；應(yīng)用免疫印跡法（Western blo

3、t）檢測凋亡相關(guān)蛋白（半胱氨酸蛋白酶-3，Caspase-3），細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC3-Ⅱ和p62），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫蛋白（CHOP和GRP78/Bip），泛素化蛋白，MAPK家族（ERK1/2和p-ERK1/2、p38和p-p38、JNK和p-JNK、cJun和p-cJun）等蛋白表達(dá)水平的變化；采用相關(guān)試劑盒檢測黃腐酚對細(xì)胞蛋白酶體活性的影響；利用透射電子顯微鏡和激光共聚焦顯微技術(shù)分析判斷黃腐酚引起的胞質(zhì)空泡的來源以及

4、胞內(nèi)LC3-Ⅱ的定位；利用活性氧熒光探針DCFH-DA、線粒體膜電勢檢測探針JC-1和碘化丙錠PI通過流式細(xì)胞術(shù)檢測黃腐酚處理后細(xì)胞活性氧、線粒體膜電位和細(xì)胞周期分布的變化。
　　研究結(jié)果：
　　第一部分 黃腐酚對白血病細(xì)胞HL-60增殖的抑制作用和相關(guān)機(jī)制
　　1.黃腐酚濃度依賴性的抑制HL-60細(xì)胞增殖，其IC50值約為11.9μM，且黃腐酚處理后的HL-60細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量胞質(zhì)空泡。2.黃腐酚一定程度上誘導(dǎo)非cas

5、pase-3依賴性的細(xì)胞凋亡，加入廣譜的caspase抑制劑z-VAD-fmk未能逆轉(zhuǎn)黃腐酚引起的細(xì)胞死亡和胞質(zhì)空泡。同時(shí)，黃腐酚將HL-60細(xì)胞周期阻滯于G1期和G2/M期。3.黃腐酚阻斷自噬體與溶酶體的融合，從而抑制自噬溶酶體的形成， 導(dǎo)致自噬流受阻，加入自噬抑制劑3-MA和Baf A1后對細(xì)胞增殖和胞內(nèi)空泡沒有影響。4.黃腐酚誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生副凋亡。胞質(zhì)空泡（來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹）對細(xì)胞造成不可逆的損傷。黃腐酚引起內(nèi)質(zhì)

6、網(wǎng)脅迫，上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫蛋白CHOP和GRP78/Bip的蛋白表達(dá)，加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫抑制劑4-苯基丁酸（4-PBA）或新蛋白合成抑制劑CHX可以顯著逆轉(zhuǎn)細(xì)胞死亡和胞質(zhì)空泡。p38MAPK信號通路參與調(diào)控黃腐酚誘導(dǎo)的副凋亡，加入p38MAPK抑制劑SB203580可以減少細(xì)胞死亡和胞質(zhì)空泡。黃腐酚引起胞內(nèi)泛素化蛋白的大量積累和蛋白酶體活性下降。同時(shí)，黃腐酚誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，引起線粒體膜電位的下降。
　　第二部分 黃腐酚對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞N

7、G108-15增殖的抑制作用和相關(guān)機(jī)制
　　1.隨著黃腐酚濃度升高，NG108-15細(xì)胞存活能力逐漸下降，其IC50值為40μM左右。2.黃腐酚未誘導(dǎo)NG108-15細(xì)胞凋亡，黃腐酚作用后NG108-15細(xì)胞周期阻滯于G1/S期。3.黃腐酚激活了胞內(nèi)ERK1/2和p38MAPK信號通路，且ERK1/2信號通路在細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞增殖抑制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　研究結(jié)論：
　　第一部分 黃腐酚對白血病細(xì)胞HL-60增殖的抑

8、制作用和相關(guān)機(jī)制
　　1.黃腐酚能夠濃度依賴性的抑制HL-60細(xì)胞的增殖，其主要作用機(jī)制為黃腐酚誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞副凋亡。黃腐酚誘導(dǎo)的副凋亡依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫，新蛋白合成，且p38MAPK信號通路參與調(diào)控黃腐酚誘導(dǎo)的副凋亡。
　　2.黃腐酚一定程度上誘導(dǎo)了非caspase-3依賴的細(xì)胞凋亡，引起了活性氧的上升，線粒體膜電位的下降和G1期和G2/M期細(xì)胞周期阻滯。
　　3.黃腐酚阻斷HL-60細(xì)胞胞內(nèi)自噬體與溶酶體的融合，

9、從而有效抑制了自噬溶酶體的成熟，導(dǎo)致自噬流受阻。
　　第二部分 黃腐酚對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞NG108-15增殖的抑制作用和相關(guān)機(jī)制
　　1.黃腐酚通過激活ERK1/2信號通路將NG108-15細(xì)胞周期阻滯于G1/S期從而抑制細(xì)胞增殖。
　　2.黃腐酚激活p38MAPK信號通路卻沒有誘導(dǎo)NG108-15細(xì)胞凋亡。
　　綜上所述，本論文發(fā)現(xiàn)黃腐酚具有較強(qiáng)的體外抗腫瘤活性，并且針對不同來源的腫瘤細(xì)胞系，抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作