hiv-1反式轉錄激活因子介導的脂質體在脊髓損傷大鼠體內分布的靶向性

1、中同脊柱脊髓 雜志 2 0 1 0年第 2 0卷第 9 期 C h i n e s eJ o u r n a lo f 印i n ea n di n a lC o r d ， 2 0 1 0 ， V o 1 ． 2 0 ， N o ． 97 7 1H I V 一 1 反 式 轉 錄激 活 因脊髓損傷 大 鼠體 內子介 導的脂質體在 分布 的靶 向性 魏 志 堅 ， 馮世 慶 ， 張 大鵬 ， 王 穎 ， 趙 鵬 ， 焦新旭 ， 常 津

2、 ， 王 漢 杰 ( 1天津醫(yī)科大學總醫(yī)院骨科 3 0 0 0 5 2 天津市 ； 2天津大學材料學院納米生物技術研究所 3 0 0 0 7 2天津市 )【 摘要 】目的 ： 探討 H I V 一 1反式轉錄激活岡子( t r a n s — a c t i v a t o rt r a n s c r i p t i o n ， T A T ) 介導 的脂質體作 為藥物載體在 脊髓 損 傷 大 鼠 體 內 分 布 的靶 向性 。 方

3、法 ：構 建 H I V 一 1T A T介 導 的納 米 脂 質 體 ，外 接 異 硫 氰 酸 熒 光 素 ( f l u o r e s —c e i ni s o t h i o c y a n a t e ， F I T C) 作 為標 記 。 取 8周 齡 雌 性 Wi s t a r 大 鼠 6 0只 ， 隨機 分 為 2組 ， 每 組 3 0只 ， 每 組 分 為 未 損 傷 、 傷 后 2 4 h及 傷 后 1 周 3個

4、 時 間 點 ， 每 個 時 間點 各 l 0只 。每 組 2 0只采 用 I m p a c t o rMo d e ll I 打 擊 建 立 T 1 0脊 髓 損 傷模 型 。 I 組 每個 時 間點 尾 靜 脈 注射 外 接 r A T的脂 質 體 ( 9g ／ m l ， 5 0 0 ~ 1 ) ， Ⅱ組 尾 靜 脈 注 射 不 接 T A T的 脂 質體 ( 9g ／ ml ， 5 0 0 t x 1 ) 。 注 射 后 1

5、 h取 出 T 7 ～ L l 節(jié) 段 脊 髓 組 織 ， 冰 凍 組 織 切 片 暗 視 野 下 觀 察 脂 質 體 在 脊 髓 組 織 中的分布情況 。結果 ： I 組未損傷 、 傷后 2 4 h及 傷 1 周 均在脊髓 內部 觀察 到 F I T C標 記的脂質體 ， 但末損傷脊髓 中脂 質 體 未 進 入 神 經 元 ， 傷 后 2 4 h及 傷 后 1 周 脂 質 體 在 損 傷 中 心 神 經 元 中 聚 集 ， 傷 后 2

6、 4 h距 離 損 傷 中心 近端 1 ． 5 c m 處 和 遠 端 1 ． 5 c m 處 神 經 元 中脂 質體 的 F I T C熒 光 平 均 光 密 度 ( A O D) 明 顯 小 于 損 傷 巾心 ( P0 ． 0 5 ) 。結 論 ： 外 接 T A T的 脂 質 體 可 以 穿 過 大 鼠正 常 的血 脊 髓 屏 障 進 入 脊 髓 內部 ， 并且 具 有 進 入 受損 脊髓 組 織 神經 元 的 靶 向 特 異 性

7、 ?！?關鍵詞 】脊髓損 傷 ； 脂質體 ； 血脊髓 屏障 ； 靶 向； 大鼠 d o i ： 1 0 ． 3 9 6 9 ~ ． i s s n ． 1 0 0 4 — 4 0 6 X ． 2 0 1 0 ． 0 9 ． 1 7中圖 分 類 號 ： R 6 8 3 ． 2 ， R 9 6 5 ． 1文 獻標 識碼 ： A文 章 編 號 ： 1 0 0 4 — 4 0 6 X( 2 0 1 0 ) 一 0 9 — 0 7 7 l 一 0

8、 5Di s t r i b u t i o nt a r g e t i n go fHI V-1t r a n s - a c t i v a t o rt r a n s c r i p t i o nm e d i a t e dl i p o s o me sf o l l o wi n gs p i na lc o r di n j u r yi nr a t s ／ WE IZ h i j i a n ， F E NGS

9、h i q i n g ， Z HA NGDa p e n g ， e ta l ／ ／ C h i n e s eJ o u r n a lo fS p i n ea n dS p i n a lC o r d， 2 0 1 0 ， 2 0 ( 9 ) ： 7 7 1 - 7 7 5【 A b s t r a c t 】 Ob j e c t i v e ： T oi n v e s t i g a t et h ei nv i v

10、od i s t r i b u t i o nt a r g e t i n go fHI V- 1t r a n s - a c t i v a t o rt r a n s c r i p t i o n( T AT) 一 me d i a t e dl i p o s o me sa sd r u gc a r r i e r si nr a t s ． Me t h o d： HI V一 1T AT— me d i a t e

11、 dn a n o l i p o s o mec o n n e c t e dw i t hf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ( F I T C)a c t i n ga san l a r k e rw e r ec o n s t r u c t e d ． 6 0f e m a l eWi s t a rr a t s ( 8w e e k )w e r er a

12、 n d o m l yd i v i d e di n t o2g r o u p sw i t h3 0a n i ma l si ne a c hg r o u p ， 3s u b g r o u p s ( n = 1 0 ) o fe a c hg r o u pw e r ed e t e r m i n e da sn od a m a g e ， 2 4 ha n d1w e e ka f t e ri n j u r

13、 y ． T I Os p i n a lc o r di n j u r y m o d e l sw e r ee s t a b l i s h e db yI mp a c t o rMo d e lI t． G r o u p1w e r ea d mi n i s t e dw i t ht a i l — v e i ni n j e c t i o no fe x t e r n a lT A Tl i p o s o

14、 me s ( 9 1 x g ／ m 1 ．5 0 0 1 x 1 )a te a c ht i m ep o i n t ； g r o u p1 1w i t ht a i l — v e i ni n j e c t i o no fl i p o s o me sa l o n e ( 9 1 x g ／ m l ， 5 0 0 ~ 1 ) ． 1ha f t e ri n j e c t i o n ， t h eT 7 一

15、 L 1s p i n a lc o r ds p e c i m e nw e r eh a r v e s t e da n do b s e r v e du n d e rd a r kf i e l dm i c r o s c o p yf o rl i p o s o m ed i s t r i b u t i o ni ns p i n a lc o r d ． R e s u l t ： F I T C — l i

16、p o s o m e sw e r eo b s e r v e di nt h es p i n a lc o r di ng r o u pIa t3t i mep o i n t s ， b u tl i p o s o me si ni n t a c ts p i n a lc o r dd i dn o te n t e rt h en e u r o n ． Att h et i mep o i n t so f2 4

17、ha n d1w e e ka f t e ri n j u r y， l i p o s o m e sa g g r e g a t i o nw e r en o t e di ni n j u r y c e n t e ri n s i d en e u r o n s ． 2 4 ha f t e ri n j u ry ， F I T Cf l u o r e s c e n c ea v e r a g eo p t i

18、 c a ld e n s i t y ( A O D) i nn e u r o n sl i p o s o m e s1 ． 5 c mp r o x i m a la n dd i s t a lt oi n j u r yc e n t e r sw e r es i g n i f i c a n t l yl e s st h a ni ni n j u r y c e n t e rf J P0 ． 0 5 ) ． C

19、o n c l u s i o n ： T h ee x t e r n a lT A Tl i p o s o m e sc a nc r o s st h en o r ma l基 金 項 目 ： 圍 家 自然 科 學 基 金 ( 3 0 8 7 2 6 0 3 ) 、 天 津 市 衛(wèi) 生 局 科 技 熏 點 基 金 ( 0 7 K G 2)第一作者簡介 ： 男( 1 9 8 4 一 ) ， 碩十研究生 ， 研究方 向： 脊柱脊髓

20、損傷 電話 ： ( 0 2 2) 6 0 3 6 3 9 3 6E— m a i l ： w e i zi a n 2 ( ) ( 】 2 @1 2 6 ． C O I n 通 訊 作 者 ： 馮 世 慶 E天 津 市 衛(wèi)生 局 科 研 基 金 ( 0 9 K Z1 0 4)ma i l ： f e n g s q 3 21 @s i n a ． c o i n中國脊柱脊髓雜志 2 0 1 0年第 2 O卷第 9期C h i n e s

21、 eJ o u r n a lo fS p i n ea n di n dC o r d ， 2 0 1 0 ， V o l2 0 ， N o ． 97 7 32結 果 2 ． 1 脂質 體表 征 分析 制備 的脂質 體用 激 光粒度 儀 測定 其粒 徑 約為 1 5 ． 5 n m， Z e t a電勢 高達 3 8 ． 2 2 mY。透射 電鏡 觀察 ，脂 質 體 粒徑 大 約 為 1 5 n m，與 粒徑 儀 所 測 結 果 類

22、似 ， 粒子 呈球 形 ， 分布 比較 均勻 ， 分 散性 較 好 ， 幾 乎 沒 有發(fā) 生 團聚現(xiàn) 象 ( 圖 1 ) 。2 ． 2 大 鼠脊 髓 中脂 質體 分 布情 況 外 接 T A T組 在倒 置 熒光 顯 微 鏡下 觀 察 ， 未 損 傷 、傷后 2 4 h及 傷 后 1周 脊 髓 內部 均 可 見 F I T C標記的脂質體 ， 未損傷時外接 r A T脂質體在脊髓 血管處聚集 ，并且在脊髓組織內部可見 F I T C熒

23、 光( 圖 2 a ) ， 提示脂質體 穿越血脊髓 屏障 ， 進入脊 髓 內部 ，熒光主要分布于血管周邊及接近血管的 白質 組織 ， 灰 質 中神經 元未 見 明顯 顆粒 聚集 ； 傷后 2 4 h ．可 見外 接 T A T脂 質 體 不僅 進 入 脊髓 實 質 內部 ， 并 且 在 神 經 元 內聚 集 ( 圖 2 b ) ， 高 倍 鏡 可 見 脂 質 體圍繞細胞核分布 ， 細胞核不著 色( 圖 2 e ) ， 提 示脂質體不能進

24、入核膜 ； 傷后 1 周外接 T A T脂質 體 在脊 髓 內分 布情 況 與傷后 2 4 h類 似 ( 圖 2 d ) 。 盡 管 脊髓 未損 傷 與損 傷后 1 周 血 脊髓 屏 障都保 持 完 整 ， 但 外接 T A T的脂質 體 只 在有 炎癥 損 傷 的脊 髓 組 織 中 的神 經 元 內聚集 ，正常 脊髓 中只在 血管 周 圍 的非 實 質 組 織 中存 在 F I T C熒 光 。在 傷 后 2 4 h脊髓連續(xù)橫切片中，

25、 遠離損傷中心的熒光 A O D值 明顯降低 ， 神經元中的脂質體越來越少 ， 其中損傷 中 心 A O D 值 為 4 1 ． 0 7 ± 9 ． 4 7 ， 近 端 1 ． 5 c m 處 為 2 1 ． 5 6 ~ 8 ． 9 7， 遠端 1 ． 5 e r a處 為 1 7 ． 8 7 ~ 1 3 ． 4 4， 遠 近端 A O D值 與 損 傷 中心 比較 均 有 統(tǒng) 計 學 差 異 ( P 0 ． 0 5 ) 。外

26、 接 T A T組脊 髓 未損 傷 時 A O D值 明 顯小 于 傷后 2 4 h和傷后 l 周 ( P0 ． 0 5 )3 討 論 3 ． 1 外接 HI V 一 1T A T脂 質體 的 表征分 析 脂質體作為一種藥物 的載體 ，使得藥物具有 生物功能、 靶 向功能和治療功能 ， 擁有 巨大的應用 前 景 。然 而 目前 的脂 質體 大都 有著 許 多不 可避 免 的缺點 ， 例如體內循環(huán)時間短 ， 物理和化學穩(wěn)定性 不 足 ，

27、囊 泡表 面 缺少 靶 向位 點及脂 質 體水溶 液 中分散性不好等I 3 _ 。本 研究 中使用的脂質體為天津 大學提供 的陽離子脂質體 ，使用十八烷基三甲基 氯 化銨 對 羥 甲基殼 聚糖 進 行 改造 ，制 備羥 甲基 十 八 烷基 季 銨鹽 ．并 用 其代 替合 成磷 脂來 制備 低 成 本高穩(wěn)定性 的高聚物脂質體 。其具備以下特點 ：( 1 ) 使 用 羥 甲基 殼 聚糖 作 為骨架 材料 替 代磷 脂 ， 在 制 備上 極

28、大簡 化 了步驟 ， 降低 了成 本 ， 更 為重 要 的 是 ， 有 研 究 發(fā) 現(xiàn) 殼 聚糖 具 有 與 細 胞 膜 磷 脂 雙 分 子層結構特異性結合的靶向性能 ，使得這種脂質 體能夠僅作用于損傷的細胞 ， 從而減少將來脂質 體 的用 量 ， 減少 毒性 ， 增 加 局部 濃度 ； ( 2 ) 合成 的脂 質體粒徑大約 1 5 n m， 粒子呈球形 ， 分布均勻 ， 幾乎 沒 有發(fā) 生 團聚 。好 的分 散性 主要 是 由于高 聚

29、物脂 質體表面含有大量的季銨基 團， 呈正 電性 ， 各個粒 子 之 間 由 于帶 同種 電荷 而 產 生 相互 排 斥 作 用 ， 小 的粒 徑 能夠 使脂 質 體更 容 易穿越 損 傷后 狹小 的縫 隙 及 破 損 的 細 胞 膜 結 構 ； ( 3 ) Z e t a電 位 可 達 到 3 8 ． 2 2 m Y，說明脂質體表面存在大量親水性季銨 基 團 。 兩 親性 高 聚物形 成 一種 穩(wěn)定 的雙層膜 結 構 ，小分 子 膽

30、固醇鑲 嵌 在雙 層膜 內起 穩(wěn) 定作 用 。脂質 體表 面含 有 大量 的季 銨基 團而呈 正 電性 ，高 的正 電性使得脂質體更加易于與表面帶負電荷的細胞 膜結 合 ， 增強 作 為高 效藥 物載 體 的跨 膜能力 。3 ． 2HI V 一 1T A T作用 T A T是一 種 由 8 6個 氨基 酸組 成 的多肽 ， 它對 于 H I V一 1病毒 復制 起著 重要 作 用 。 有研 究證 明 1 ，T A T可高效通過細胞膜發(fā)

31、揮生 物學效應 ， 在體外 實驗 中達到最大生物學作用時僅需 5 m i n ， 而且低 溫并不 影 響它 的作 用 ，為 人們 提供 了一種 可行 的 細胞膜 轉 導途 徑 。實驗 證 明它 可 以穿越 生物 膜屏 障 如 血 脊 髓 屏 障 ( b l o o d — s p i n a lc o r db a r r i e r ，B S C B) ，它 的膜 穿 透特 性 主要 由其 中 的一小 段 肽 鏈 ( 第 4 7 —