EGFR受體介導(dǎo)肺腫瘤靶向siRNA脂多胺修飾脂質(zhì)體的體內(nèi)動態(tài)與藥效學(xué)評價.pdf

1、目的：構(gòu)建EGFR受體介導(dǎo)肺腫瘤靶向survivin siRNA和MRP1 siRNA共負(fù)載脂多胺修飾脂質(zhì)體(EGFR-PEG-NCLs-siRNA)，評價其制劑學(xué)性質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)動態(tài)、體內(nèi)組織分布以及與順鉑聯(lián)合用藥的抗腫瘤效果。
　　方法：通過置換和酰胺化反應(yīng)合成類脂質(zhì)陽離子載體材料N,N'-二油酰三羥甲基氨基甲烷（2-氨基乙基）胺(N，N'-dioleoyl tris(2-aminoethyl) amine，NDOA)，并合成聚乙

2、二醇(PEG)馬來酸嫁接二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DEPE)。通過硅膠薄層色譜法(TLC)、傅里葉紅外光譜法(FT-IR)和核磁共振法(1H-NMR)等對上述合成產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)驗證。采用乙醇注入法制備陽離子脂質(zhì)體，并測定其粒徑，Zeta電位和FAM-siRNA的包封率。以人源非小細(xì)胞肺腺癌A549細(xì)胞和耐順鉑株A549/DDP細(xì)胞為模型，以MTT法考察空白長循環(huán)陽離子脂質(zhì)體(PEG-NCLs)對A549與A549/DDP細(xì)胞的安全性。采用流式

3、細(xì)胞儀(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)和激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope，CLSM)考察A549/DDP細(xì)胞對EGFR-PEG-NCLs的攝取及其從A549/DDP細(xì)胞溶酶體中的逃逸。采用FCM考察EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA對A549/DDP細(xì)胞的凋亡。采用熒光實時定量PCR(RT-PCR)考察EGFR-PEG-NCLs-survivin/MRP

4、1 siRNA對A549細(xì)胞的基因沉默。噴霧冷凍干燥法將脂質(zhì)體制成微粉供肺部干粉吸入給藥。以帶綠色熒光的人源性肺腺癌細(xì)胞株Luc-A549建立裸鼠原位肺癌模型，用小動物活體成像儀考察負(fù)載siRNA的脂質(zhì)體通過肺部吸入與尾靜脈注射給藥時在體內(nèi)各組織器官分布情況;并考察負(fù)載survivin siRNA和MRP1 siRNA的脂質(zhì)體與順鉑聯(lián)用時抑制腫瘤生長的效果。最后，通過蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-eosin stainin

5、g，H&E)考察給藥對各組織器官的影響。
　　結(jié)果：經(jīng)TLC，1H-NMR和FT-IR法驗證了陽離子載體材料NDOA的成功制備，其純度為87％; DSPE-PEG2000-Mal經(jīng)TLC和1H-NMR法驗證產(chǎn)物合成，其純度為86.2％。PEG-NCLs的粒徑為(193.2±3.4)nm，Zeta-電位為(7.9±0.1)mV，F(xiàn)AM-siRNA的包封率為（91.9±0.8）％。TEM圖結(jié)果顯示，所制得脂質(zhì)體粒度均勻，顆粒圓整，分散

6、性良好。攝取結(jié)果表明，EGFR靶向可以明顯提高A549/DDP細(xì)胞對PEG-NCLs的攝取能力，其攝取能力是未經(jīng)EGFR修飾的1.4倍。CLSM結(jié)果顯示，EGFR-PEG-NCLs-siRNA可從A549/DDP細(xì)胞的溶酶體中成功逃逸。EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA組的凋亡率為(41.14±1.68)％，約為Lipofectamine-2000組（19.86±1.30）％的2倍。EGFR-PEG-NCLs-su

7、rvivin siRNA的基因沉默率為(96.7±1.2)％，EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA的基因沉默率為(50.0±16.1)％，均有良好的基因沉默效果。此外，EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA和EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)A549細(xì)胞后，A549細(xì)胞對順鉑的敏感性提高。體內(nèi)組織分布結(jié)果顯示，脂質(zhì)體通過肺部吸入相對于尾靜脈注射在肺部停留時間久，并且靶向性較好。抑瘤實驗結(jié)

8、果表明，順鉑(DDP)與EGFR-PEG-NCLs-survivinsiRNA與EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA聯(lián)合給藥具有明顯的抑制腫瘤生長的作用。H&E染色結(jié)果表明， DDP與EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA與EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA聯(lián)合給藥對腫瘤的殺傷能力最強(qiáng)，且不會對各組織器官造成損傷，安全性較好。
　　結(jié)論：制備的EGFR受體介導(dǎo)肺腫瘤靶向siRNA脂多修飾