靶向HIV-1的高效多靶點RNAi元件的研究.pdf

1、艾滋病已成為一場人類、社會和經濟的災難,對個人、社區(qū)和國家都產生了深遠影響。目前常用的艾滋病治療方法是化學藥物的雞尾酒療法,該方法可明顯降低患者體內的病毒載量,控制病情的發(fā)展。然而,該方法并不能達到治愈艾滋病的效果,急需開發(fā)新的更為有效的治療方法。RNAi是近年來發(fā)現(xiàn)的一種序列特異性的轉錄后水平抑制基因表達的機制,目前已在HIV-1的抗病毒研究中顯示出巨大的應用潛力。然而,HIV-1具有的高突變率使得病毒很容易逃避傳統(tǒng)的單靶點RNAi的

2、抑制。多靶點策略是克服病毒突變逃避抑制的有效方法,本研究的目的即在于篩選靶向HIV-1的高效的RNAi靶點并通過人工簇狀miRNA結構實現(xiàn)多個抗病毒siRNA的共表達,以獲得更為理想的抗病毒效果,為進一步應用RNAi技術進行新型艾滋病治療方法的研究提供重要的基礎。
　　 本研究首先通過規(guī)?；Y選獲得靶向HIV-1的兼具高抑制效率和高保守性特征的RNAi靶位點。以HIV-1NL4-3為靶序列選擇設計了153個siRNA,主要分別靶

3、向gag、pol、vif,vpu基因,在pSUPER質粒上構建了對應的shRNA表達質粒。各shRNA表達質粒分別與HIV-1感染性克隆pNL4-3共轉染293FT細胞,通過檢測細胞培養(yǎng)上清中HIV-1編碼蛋白p24的活性,篩選出具有高抑制效率的RNAi靶序列。同時通過保守性分析、干擾素免疫反應的檢測及進一步的對多亞型病毒的抑制效率實驗篩選獲得4個兼具高抑制率和高保守性特征的RNAi靶位點,分別為po11102和po11026(靶向po

4、l基因),vif37和vif9(靶向vif基因)。將RNAi的靶序列插入到熒光素酶基因的3'UTR區(qū),構建了一系列的報告質粒。pSUPER-shRNA分別與對應的報告質粒的共轉染,po11102、po11026、vif37和vif9僅僅抑制含有相應靶序列的報告基因的表達,證明了抑制效果的特異性。本研究進一步選擇Do11102和vif37靶點分別構建shRNA表達元件及通過化學方法合成siRNA驗證其在細胞感染模型中的抗HIV-1的能力。

5、MT-4是能夠支持HIV-1體外復制的T淋巴細胞系。本研究構建了攜帶靶向po11102和vif37靶點的shRNA表達元件的重組慢病毒載體,轉導MT-4細胞分別篩選獲得了可穩(wěn)定表達靶向po11102和vif37靶點的siRNA的細胞株,攻毒實驗顯示上述細胞株可有效抑制HIV-1的感染和復制。本研究通過化學方法進一步合成了靶向vif37靶點的siRNA,分別采用不修飾、甲氧基修飾、膽固醇修飾的合成方式,檢測結果顯示3種修飾方式合成的siR

6、NA均能夠有效抑制HIV-1的復制表達,其半數(shù)抑制劑量(ED50)分別為1nmol、1nmol、2nmol。
　　 本研究顯示對穩(wěn)定表達靶向po11102和vif37靶點的siRNA的MT-4細胞株進行長期連續(xù)攻毒實驗可獲得逃避抑制的突變病毒,本研究對11株vif37靶點的突變株進行了靶點區(qū)域的測序分析,發(fā)現(xiàn)病毒突變集中于RNAi靶點區(qū)中部的兩個位點,突變方式主要是同義突變或者同類氨基酸替換。該結果這說明單靶點策略是不足以應對H

7、IV-1的突變逃避的,采用多靶點抑制策略是十分必要的。天然miRNA中存在少量的簇狀結構,一個順反子經過剪切、加工后可以得到多個不同的成熟miRNA,本研究探索采用以天然miRNA基因簇骨架構建多靶點RNAi元件。以天然簇狀miRNA(miR-17-92)為骨架,將其中的miRNA序列(miRNA17、18、19a、20、和19b-1)分別替換為siP24、siPOL、siVIF1、siVIF2、siTAT的序列,得到可同時表達5個抗病

8、毒siRNA的簇狀miRNA結構BHS。BHS分別與含靶點序列的熒光素酶報告質粒共轉染,結果顯示5個siRNA中只有siTAT較好的保持了抑制效果,并沒有達到同時表達多個抗病毒siRNA的目的。本研究還嘗試將兩個有效的抗病毒miRNA前體直接相連,構建2靶點RNAi表達結構,但是兩個靶點中只有一個較好的保持了抑制效果。
　　 分析了上述的實驗結果并考慮到HIV-1的基因組中含有天然的miRNA,本研究重新設計了構建多靶點RNAi

9、元件的策略,以源自HIV-1的反義RNA序列作為連接序列,采用靈活的克隆構建方法,將多個抗病毒miRNA以不同的組合和順序連接起來,得到不同的人工簇狀miRNA結構,用實驗的方法從中選出有多靶點RNAi效果的表達結構。通過以天然的miRNA(miR-30a或miR-155)為骨架構建靶向HIV-1的19011102、po11026、po11402、vif9和vif37靶點的miRNA元件,采用與HIV-1感染性克隆共轉染的方式檢驗獲得有

10、效的單個miRNA表達結構。在獲得有效的單個miRNA元件序列的下游添加一段HIV-1反義RNA構成的連接序列,組成一個包含miRNA前體和連接序列的串聯(lián)單元,并用共轉染熒光素酶報告基因的方式,選擇具有抑制效果的單元進行后續(xù)的多靶點元件組合實驗。將獲得的靶向po11402、po11102和vif37靶點的miRNA串聯(lián)單元以不同的組合和順序連接成為不同的3靶點miRNA結構,通過抑制效率評價實驗篩選獲得了一組具有良好3靶點抑制效果的簇狀

11、miRNA組合結構(tri-miRNA),其對HIV-1的抑制效果優(yōu)于單個的miRNA元件,并可以有效抑制逃逸突變的產生。在脫靶效應評價實驗中,tri-miRNA在細胞中的穩(wěn)定表達不會影響細胞的增殖,不會干擾內源性的天然miRNA的加工、成熟,也不會引發(fā)干擾素免疫反應,沒有檢測到明顯的細胞毒性。為進一步驗證本研究的多靶點簇狀miRNA構建方法的適用性,進一步在tri-miRNA的下游添加了兩個miRNA串聯(lián)單元,得到含有5個miRNA的

12、簇狀miRNA組合結構(quin-miRaNA),其對應靶點依次為po11402、vif37、po11102、po11217和po11026。Quin-miRNA中有4個miRNA在熒光素酶共轉染實驗中表現(xiàn)出明顯的抑制效果,在細胞中的穩(wěn)定表達沒有檢測到可見的副作用,可以高效抑制病毒的復制。本研究探索建立了構建高效靶向HIV-1的多靶點RNAi元件的構建策略,獲得了一批高效的RNAi靶點和具有較好應用潛力的多靶點RNAi元件,為進一步以R