nk92細(xì)胞的胞吐效應(yīng)與snap-23蛋白轉(zhuǎn)位相關(guān)_第1頁(yè)
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1、中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志 2 0 0 5 年 2 月第鲞第 2le b型 ,塹,:N K 9 2細(xì)胞 的胞 吐效應(yīng)與 S N A P 一 2 3蛋 白轉(zhuǎn)位相關(guān) 鄭芳吳群 姜小丹馮瑋熊平 劉君炎 龔非力. 基 礎(chǔ) 免 疫 學(xué) .【 摘要 】目的 研究 S N A P - 2 3 蛋白在 N K細(xì)胞系 N K 9 2 細(xì)胞胞吐效應(yīng)中的作用 , 探討 N K細(xì)胞胞 吐的分子機(jī)制。方法 利用已糖氨酶( ~ - h e x o s a m i

2、n i d a s e ) 釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè) N K細(xì)胞的胞吐作用。通過(guò) R T -P C R和 W e s t e r nb l o t 顯示 N K 9 2 細(xì)胞中 S N A P - 2 3 am R N A和蛋 白的表達(dá) , 利用激光共聚焦顯微鏡掃描術(shù) 確定靶細(xì)胞觸發(fā)前后 S N A P - 2 3 a 在 N K 9 2 細(xì)胞中的定位。 結(jié)果 N K細(xì)胞的胞吐作用在靶細(xì)胞刺激后 2h 明顯, 4 ~ 6h 達(dá)高峰 ; N K 9

3、2 細(xì)胞組成性表達(dá) S N A P - 2 3 ar n R N A和蛋白, 靶細(xì)胞刺激前后蛋白表達(dá)量雖 無(wú)明顯差異, 但其定位發(fā)生了顯著改變: 激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果顯示在靜息 N K 9 2中 S N A P - 2 3 a 主 要表達(dá)在胞漿內(nèi)的顆粒上 , 經(jīng)靶細(xì)胞刺激后逐漸向細(xì)胞膜發(fā)生轉(zhuǎn)位 , 2h 明顯轉(zhuǎn)位 , 4 ~ 6h 幾乎完全轉(zhuǎn) 位。結(jié)論 N K細(xì)胞的胞吐效應(yīng)與 S N A P - 2 3 蛋白轉(zhuǎn)位相關(guān)?!?關(guān)鍵詞 】

4、 S N A P - 2 3 ;自然殺傷細(xì)胞; 豬內(nèi)皮細(xì)胞 ; 轉(zhuǎn)位; 胞吐效應(yīng) As s o c i a t i o no fS NAP . 2 3p r o t e i nt r a n s l o c a l i o nt ot h ee x o c y t o s i sf r o m NK9 2c e l ll i l l ez J 踟 F a n g,WU, J I A N G X i a o - d a n , F E

5、N GW e i ,D Ⅳ G, l g ,J u n - y o n , G O N GF e i - l i . I n s t i t u t eo f I m m u n o l o g y ,%, lMe d i c a lC o l l e g e.H Us T。Wu h a n4 3 0 o 3 o.C h i R 8C o r r e s p o n d / r i ga l / t ~ r :G oN GF eb.Em

6、 a g:F L G oNG@ I 6 3. c o m 【 A b s t r a c t 】O b j e c t i v eT h ef u n c t i o no fS N A P - 2 3p r o t e i nw a ss t u d i e dt oi l l u s t r a t et h em o l e c u l a rm e c h a —n i s m o fe x o c y t o s i sf

7、r o mNK c e l ll i n e - NK 9 2. M e t h o d sG - h e x o s a mi n i d a s er e l e a s ea s s a yW a s u s e dt od i s p l a yt h ee x .o c y t o s i sf r o m N K c e l s .E x p r e s s i o no fS N AP - 2 3 ai nmR N

8、Aa n dp r ot e i nl e v e li nh u ma nM (c e l l swe r ed e t e c t e d b yR T - P C Ra n dW e s t e r n b l o t .C o n f o c a l l a s e rmi c r o s c o p yWa s u s e dt od e f t n e d t hel o c a t i o no fS NA

9、P - 2 3 ai nNK c e l l sp r ea ndp o s ta c t i v a t e d .Re s u l t sT h ee x o c y t o s i sf r o m NKc e l sW a s o b ~ o u so f 2ha ndr e a c h e d p e a ka t4 - 6ha f t e rs t i m u l a t i o nw i t hp o r c i

10、n ee n d o t h e l i a lc e l l s ( P E C ) . I tW a sc o n f i r m e dt h a tS N A P 一 2 3 aW a sc o n s t r u c t i v e l ye x p r e s s e da tmRN Aa n dp r ot e i nl e v e l si nh u ma nM (c e l s .A l t ho u g ht heq

11、 u a n t i t yo fS NA P - 2 3 ad i d n’ tc h a n g ei nr e s t i n ga n da c .t i v a t e d NKc e l l s . t hec o n f o c a ll a s e rmi c r o s c o p ys h o w e d t h a tS NAP - 2 3W a s l o c a t e d p r i ma r i

12、 l yi ng r a n u l e so fc y t o p l a sm a ndt r a n s l o c a t e d i nc e lp l a smame n l b r a n ea f t e ra c t i v a t i o nb yP EC.I nr e l o c a t i o np r o c e s s .i ts h o we d t h a to b v i o u s l ya t2

13、ha n dr e a c h e dp e a l ‘a(chǎn) t4 . 6h.Co n c lu s i o nI tW a s c o n c l u d e d t h a tt hee x o c y t o s i sf r o m M(c e l swa sa s s o c i a t e d t ot het mn s l e ca t i o no ft heS NAP - 2 3 ap r o t e i n .【

14、K e yw o r d slS N A P - 2 3 ;N a t u r a lk i l e rc e l l ;P o r c i n ee n d o t h e l i a lc e l l ( P E C ) ;R e l o c a t i o n 胡t :E x o c y t o s i sN K細(xì)胞 ( n a t u r a lk i l l e rc e l 1 ) 是 一種重要 的免疫 細(xì)胞 , 與靶細(xì)胞直

15、接接觸后發(fā)生胞吐效應(yīng) , 釋放穿孔 素 、 顆粒酶 、 細(xì)胞因子等介質(zhì) , 殺傷靶細(xì)胞 , 從而參與 抗病毒 、 抗 腫瘤 和移植排斥 反應(yīng) 等。 目前 對(duì) N K細(xì) 胞胞吐的分子機(jī)制 , 如 哪些 分子參與細(xì)胞 內(nèi)顆 粒的 轉(zhuǎn)運(yùn)、 膜融合等的研究, 未見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái), 對(duì)免疫 細(xì)胞 中化學(xué)效應(yīng)遞質(zhì) 釋放分子機(jī) 制的研 究發(fā)現(xiàn) , 胞 內(nèi)形成的以可溶性 N S F附著蛋 白受體 ( s o l u b l eN . e t h .y l

16、 m a l e i m i d e - s e n s i t i v ef a c t o ra t t a c h m e n tp r o t e i n ,S N A R E )基金項(xiàng) 目: 國(guó)家 自然科學(xué)基 金 ( 3 0 4 0 0 3 9 0 ) ; 華 中科 技大 學(xué)醫(yī)理 交 叉 基金 、 基礎(chǔ) 醫(yī)學(xué)院基金資助 作者單位 : 4 3 0 0 3 0武漢 , 華 中科技 大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研 究所 通訊作者: 龔非力

17、, E m a i l : F L G O N G @1 6 3 . c o r n , 電話: 0 2 7 — 8 3 6 9 3 5 0 0為核心的蛋白復(fù)合體在介導(dǎo)分泌囊泡的運(yùn)動(dòng)和融合 中發(fā)揮重要 作用。肥 大細(xì)胞uJ 、 血小板 等免疫相 關(guān)細(xì)胞的囊泡 分泌 和免疫 效應(yīng)與 S N A P . 2 3蛋 白有 關(guān) 。本課題擬對(duì) S N A P . 2 3 蛋 白在 N K細(xì)胞胞吐效應(yīng) 中的作用進(jìn)行研究 , 為揭示 N K細(xì)胞胞 吐

18、的分子 機(jī) 制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù) , 為調(diào)節(jié) N K細(xì)胞 的殺傷 功能提供 新思路。由于 N K細(xì)胞僅 占正常人外周血 淋巴細(xì)胞 1 0 % ~ 1 5 % , 常規(guī)分 離方法難 以獲得 足夠數(shù)量 和純 度 的 N K細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究 , 故本研究應(yīng)用 N K細(xì)胞 系——N l ( 9 2 細(xì)胞系作為研究對(duì)象。N K 9 2細(xì)胞 系來(lái) 源于人非何杰金淋 巴瘤 , 其表型和生物學(xué)功能最 接 近正常的新鮮 N K細(xì)胞 , 且殺傷活性強(qiáng) , 易 于

19、大規(guī)模 質(zhì)控培養(yǎng) , 現(xiàn)被廣泛用 于 N K細(xì)胞相關(guān)研究 J 。維普資訊 http://www.cqvip.com 2 0 0 5 年2 月第2 5 卷第2 期 C h i nJM iⅪ 0 1 [ m m u n o l , F e b n m r ~ 2 ( ] 0 5 . v 凸 【 2 5 ,N 0 . 2白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 圖3 ) 。I2b P圖 2S N A P - 2 3R T - P C R 產(chǎn)物鑒定 魂 2

20、 . I d e n l i l k a t ~a0 f S N A P . 2 3R T - P C Rp r o d u c t: 】 0 0b PD N Al a d d ~; 2 : S N A 1 : 2 3c 6 _ 3 6I 】 pJ圍 3S N A P - 2 3 蛋白質(zhì)的免疫印連分析 r a g3.W e s t e r nb l o t∞ o fS N AP- 2 31 : R 嘲 i n gN K 9 2c e

21、l l s ; 2 : a c f i v a u dN X9 2c e l l s4 . 激光共聚焦顯微鏡顯示 i A P - 2 3 轉(zhuǎn)位: 靜息 狀態(tài) N K 9 2 細(xì)胞組成性表達(dá) S N A P . 2 3 蛋 白( 紅色熒 光) , 主要定位于胞漿部分, 分布較均勻但呈現(xiàn)顆粒 樣; N K 9 2 細(xì)胞與 P E C相互作用 2h , S N M~ - 2 3 蛋白在 胞漿中的表達(dá)顯著減少, 胞膜附近表達(dá)水平明顯增 高; 4

22、 ~ 6h 后 S N A P - 2 3 蛋白幾乎全部定位在細(xì)胞膜 附近, 并有一定集聚現(xiàn)象。提示 N K 9 2細(xì)胞被 P E C激活后, 其胞漿內(nèi)的 S N A P - 2 3 蛋白逐漸向胞膜轉(zhuǎn)位 并聚集( 圖4 ) 。析 圖4 靜止和活化 N K細(xì)胞中S N A P - 2 3 蛋白質(zhì)的定位分 ng4 .L0 fS Ng P - 2 3i a仰dvNK9 2: R e s t i n gN K 9 2 ;2 - 5 :~t l

23、, t a t e dN K 9 2 : 2hr4h . 6h .8h討 論 對(duì)神經(jīng)末梢化學(xué)遞質(zhì)釋放的研究發(fā)現(xiàn) , 突觸末 梢的3種蛋白——s N A P、 突觸前膜上的 s y n t a x i n蛋白和突觸小泡膜上的相關(guān)蛋白( V A M P ) , 都是 N S F( N E M敏感融合蛋白) 和 S N A P ( 可溶性 N S F附著蛋 白) 的膜受體, 三者聚合形成穩(wěn)定的 S N A R E核心蛋 白 復(fù)合體, 參與囊

24、泡的外排和遞質(zhì)釋放 。對(duì)肥大 細(xì)胞、 血小板和嗜堿性粒細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞研究 表明, 參與S N A R E 蛋白 復(fù)合體的不是 S N A P - 2 5 而是 變異體 S N A P - 2 3。S N A P . 2 3 蛋白是與非神經(jīng)系統(tǒng) 細(xì)胞囊泡的生物學(xué)功能密切相關(guān)的蛋白分子, 參與 多種囊泡的外排 和脫顆粒過(guò)程。如 : 血小板 中致密 囊泡的釋放 、 M D C K ( M a d i nd a r b yc a n i n

25、 ek i d n e y ) 細(xì) 胞中轉(zhuǎn)移園子受體的循環(huán) 和脂肪細(xì)胞中的葡萄糖 轉(zhuǎn)運(yùn)體動(dòng)員 。在脊椎動(dòng)物中, S N A P - 2 3 基因來(lái)源 于 S N A P - 2 5基 因, 在氨 基酸水平 上相 似性 可達(dá) 7 2 %。根據(jù) S N A P - 2 3 基因轉(zhuǎn)錄后剪切方式的不 同, 可得到 5 種不同的亞型 S N A P- 2 3 a ~ e , 但能與s y n t a x i n 和 V A M P緊密結(jié)合的只有

26、S N A P- 2 3 a 和 b . 其 中, S N A P- 2 3 a 有 2 1 1 個(gè)氨基酸,, 為 2 8 . 8 ×1, 而 S N A P- 2 3 b 和 2 3 a 相比在第 9 0—1 4 2 位缺失了5 3個(gè) 氨基酸,僅為 1 7 . 8 × l”。我們根據(jù) G e n B a n k中已報(bào)道的 S N A P . 2 3 全長(zhǎng) c D N A 設(shè)計(jì)引物, 可以擴(kuò)增得到與預(yù)期大小一致的特

27、異性 R T - P G R產(chǎn)物, 證明人類 N K細(xì)胞 中有 S N A P - 2 3m R N A 表達(dá)。進(jìn)一步用特異性結(jié)合 S N A P - 2 3 氨基端 第2 ~ l 9 位氨基酸的抗體檢測(cè), 顯示 N K細(xì)胞 中存在 大約 2 9xl的抗體特異性蛋白, 表明 N K細(xì) 胞表達(dá) S N A P - 2 3 蛋白, 而且是 S N A P - 2 3 a 亞型。靜息 狀態(tài)時(shí), N I O2 細(xì)胞中的 S N A P - 2

28、3 蛋自主要分布在胞 漿內(nèi)的顆粒上, 這與此前在其它細(xì)胞研究中的結(jié)果 是不同的 。 “ 。經(jīng)靶細(xì)胞 P E C免疫激活后 , S N A P - 2 3蛋白 表達(dá)量無(wú)明顯變化, 但發(fā)生了明顯的 轉(zhuǎn)位, 由 胞 漿內(nèi)的顆粒逐漸向細(xì)胞膜表面運(yùn)動(dòng), 并且?guī)缀跞?轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜上, 與此同 時(shí), N K細(xì)胞出 現(xiàn)胞吐, 其時(shí) 相變化與 S N A P - 2 3 蛋白轉(zhuǎn)位的時(shí)相變化一致, 提示 N K細(xì)胞的胞吐效應(yīng)與 S N A P- 2 3

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