peg-pe載藥膠束的體內(nèi)分布與毒性研究

1、東； o 南u t h 大eas 學(xué)t Un 學(xué)i v囂醫(yī) c 學(xué) i E 版 d i ；2 o 1 1 ， F e b ； 3 0 ( 1 ) J S o u t h e a s t U n i vM e d S cE d： l l 。 l 8() ?‘ 一 ’‘· 1 1 ·P E G — P E載藥 膠 束 的體 內(nèi)分布 與 毒性研 究 魏 秀莉 ， 汪貽廣 ， 曾文峰 ， 張碩 ， 于麗娟 ， 秦蕾 ， 張春

2、玲 ， 梁偉 ( 中國科學(xué)院 生物物理研究所 ， 北京 1 0 0 1 0 1 )[ 摘要]目的： 研究 P E G — P E載藥膠束靜脈給藥后在動(dòng)物體 內(nèi)的分布與毒性。方法： 采用一步 自組裝法制備 載阿霉素的單一 P E G - P E膠束或加入卵磷脂( H S P C ) 的混合膠柬( M — D o x s ) ； 用 B A L B ／ c 小鼠考察 P E G — P E載 藥膠柬 的體 內(nèi)分 布 以及 對 動(dòng) 物 生化

3、指 標(biāo) 及 臟 器 的影 響。結(jié) 果 ： 制 備 了 3種 不 同粒徑 的載 藥膠 束 ： M1 - D o x『 P E G — P E ／ H S P C：1 ： 0 ， ( 1 4 ． 5±1 ． 2 )n m] 、 M ， - D o x IP E G — P E ／ H S P C=1 ： 0 ． 5 ， ( 2 2 ． 4±0 ． 9 )n mI 與 M3 一 D o x[ P E G - P E ／ H

4、 S P C= 1 ： 1 ， ( 3 4 ． 2 ± 1 ． 3 ) n m] 。加入 H S P C后膠束的形貌由球形逐漸 變?yōu)榘魻罱Y(jié)構(gòu)。M 。 D o x s 在 肝、 肺、 腎及腫瘤 中的分布呈粒徑依賴性。在 2 2 ． 5m g · k g劑量下， Ml - D O x 與 M 3 - D o x 組的動(dòng)物生存期 明顯 延長。M — D o x s 可顯著降低對動(dòng)物的全身毒性。結(jié)論： 粒子的大小與形貌可改變

5、 M ‘ D o x s 在體 內(nèi)的分布， 減輕 藥物的全身毒性。通過對納米載藥系統(tǒng)的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行修飾， 可改變其在體 內(nèi)的行為。[ 關(guān)鍵詞]阿霉素； P E G — P E ／ H S P C膠柬； 粒徑和形貌 ； 體 內(nèi)分布； 毒性 [ 中圖分類號]R l l 4[ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[ 文章編號]1 6 7 1 ‘ 6 2 6 4 ( 2 0 1 1 ) 0 1 。 0 0 1 卜0 8d o i ： 1 0 ． 3 9 6 9

6、 ／ j ． i s s n ． 1 6 7 卜6 2 6 4 ． 2 0 11 ． O 1 ． 0 0 3S t u d yo ft h eb i o d i s t r i b u t i o na n dt o x i c i t yo fd o x o r u b i c i ne n c a p s u l a t e di nP EG- P E mi c e l l e si nmi c eWE IX i u 。 l i

7、， WA N GY i 。 g u a n g ， Z E N GWe n 。 f e n g ， Z H A N GS h u o ， Y UL i ’ j u a n ， Q I NL e i ，Z HANG Ch u n ’ l i n g， L I ANG W e i( I n s t i t u t eo fB i o p h y s i c s ， C h i n e s eA c a d e m yo fS c i e

8、 n c e s ， B e i j i n g1 0 0 1 0 1 ， C h i n a )[ A b s t r a c t ] O b j e c t i v e ： T oi n v e s t i g a t et h eb i o d i s t r i b u t i o na n da c u t et o x i c i t yo fd o x o r u b i c i nl o a d e di nP E G

9、。 P Eb a s e dm i c e l l e s ( M。 D o x s ) f o rm i c et h r o u g ht h et a i lv e i ni n j e c t i o n ．Me t h o d s ：D o x o r u b i c i nw a sl o a d e di nt h es i m p l eo rm i x e dm i c e l l e sm a d ef r o mp

10、 o l y e t hy l e n eg l y c o l — p h o s p h a t i d y l e t h a n 0 l a m i n ea l o n e( P E G ‘ P E)o rc o m b i n e dw i t hh y d r o g e n a t e dp h o s p h a t i d y l c h o l i n e( H S P C)b yas e l f - a s s

11、e m b l yp r o c e d u r e ． D i f f e r e n td o s e so ff r e ed o x o r u b i c i n( F - D o x ) a n de q u i v a l e n td o s e so fM。 D o x sw e r ei n t r a v e n o u s l yi nm i c et oc o m p a r et h e i rb i o d

12、 i s t r i b u t i o na n da c u t et o x i c i t i e s ．Re s u l t s： T h ei n c r e a s e dmo l a rr a t i o so fHS P Ci nt h eP EG。 P Eb a s e dmi c e l l e si n c r e a s et h ep a r t i c l es i z e( o n ed i m e n

13、s i o ne l o n g a t i o n ) a n dc h a n g et h e i rs h a p e sf r o mt h es p h e r i c a lt ot hew o r ml i k e 。 r o d ．T hem e a ns i z e so fMv D o x ( P E G 。 P E ／ H S P C=1 ： 0 ) ， M 2 ’ D o x ( P E G ’ P E ／ H

14、 S P C=1 ： 0 ． 5) a n dM3 。 D o x( P E G ’ P E ／ H S P C=1 ： 1 ) a r e( 1 4 ． 5±1 ． 2 ) n m， ( 2 2 ． 4±0 ． 9 ) n m，a n d ( 3 4 ． 2±1 ． 3 ) n m，r e s p e c t i v e l y ． B i o d i s t r i b u t i o no fM— D

15、 o x ss h o w e das i g n i f i c a n t l ys i z ea n ds h a p e ‘ d e p e n d e da c c u mu l a t i o ni nl i v e r ， l u n g ，k i d n e ya n dt u mo r ． M l - DO xa n dM2 - Do xe x h i b i t e d[ 收稿 日 期 ] 2 0 1 0 。 1 0

16、 — 2 9[ 修回 日 期 ] 2 0 1 0 - 1 2 一 叭[ 基金項(xiàng) 目]國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng) 目( 2 0 0 7 C B 9 3 5 8 0 1 ； 國家 自 然科學(xué)基金資助項(xiàng) 目( 3 0 9 0 1 8 6 9 )[ 作者簡介]魏秀莉 ( 1 9 7 5 一 ) ， 女 ， 山東壽光人 ， 助理研究員 ， 藥劑學(xué)博士， 研究方向?yàn)槲⒘＝o藥系統(tǒng) 。E — m a i l ： w e i x l @m o o n ． i

17、 b p ． a c ． c n[ 通信作者 ] 梁偉 E 。 m a i l ： w e i x x @s u n 5 ． i b p ． a c ． 1 2 1 1魏秀莉， 等． P E G — P E載藥膠柬的體 內(nèi)分布與毒性研究· 1 3·線。取 M — D o x s 溶液 1 0 0， 加入 9 0 0流動(dòng)相稀釋 ，渦旋混合提取藥物， 取 2 0藥物提取液注入高效液 相色譜儀中， 記錄峰面積 ， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)

18、 曲線計(jì)算 M 。 D o x s中阿霉素的濃度。1 ． 4 ． 3 載藥 P E G — P E 膠束的體外表征 1 ． 4 ． 3 ． 1動(dòng) 態(tài)光 散射 分析 采用 動(dòng) 態(tài)光 散射 法 ( d y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n g ， D E S ) 測定 M - D o x s 的粒徑分 布與 ∈電位 ( z e t ap o t e n t i a 1 ) 。用 M i n i - Q水

19、將 M - D o x s樣品稀釋至 1m g · m l ～， 取 1m l 樣品測定其粒徑分布。儀器的激光束波長設(shè)定為 6 3 3n m， 入射光與散射光束 的夾 角為 9 0 。 。每份樣 品測定 2 0個(gè) 物 質(zhì)循 環(huán) 時(shí) 間 ， 測 定溫度設(shè)定為 2 5c I = 。每個(gè)制劑的測定結(jié)果為 3 批制 劑測定結(jié)果 的平均值 ， 同時(shí)測定 3種膠 束制 劑的 電位 。1 ． 4 ． 3 ． 2 透射電鏡分析 采用 P h

20、i l i p sT e c n a i2 0透射 電子顯微鏡觀察膠束 的形貌。用 M i l l i — Q水將 M‘ D o x s樣品稀釋至 1m g · m l ～。取 1 Ol 膠束溶液滴加至具 有碳膜覆蓋的銅網(wǎng)上， 待樣品吸附3 0m i n 后 ， 滴加 1 ％醋酸雙氧鈾進(jìn)行負(fù)染， 用濾液吸去多余的負(fù)染液， 烘干 后進(jìn)行電子顯微鏡觀測， 透射電鏡工作電壓為 1 2 0k V 。1 ． 4 ． 3 ． 3 藥物包封

21、率測定 采用超濾法測定載藥膠 束的藥物包封率。取 0 ． 5m l 膠束 溶液置 于超濾 管 ( M WC O3 00 0 0 ，M i l l i p o r e ) 中 ， 4o C下 1 20 0 0xg離心 1 0m i n ， 采用高效液相色譜測定下層濾液中游離藥物 的濃度 ， 按下列公式計(jì)算膠束的藥物包封率。包 封 率 =蕓× t o 0 ％其中， c M ． D為 M · D o x 溶液的濃度 ， c

22、 F ．為超濾液 中游 離阿霉素濃度 。1 ． 4 ． 3 ． 4 膠束體外釋藥 采用平衡透析法測定藥物 釋放動(dòng)力學(xué)。用 P B S緩沖液將膠束稀釋成藥物濃度 為 1m g · m l 一的溶液。取膠束稀釋液各 2m l 裝入透析 袋( M WC O1 00 0 0 ， P i e r c e ) 中， 密封后 置于含 1 5 0m lP B S 緩沖液( p H7 ． 4 ) 的溶出杯中， 3 7℃ ， 5 0r ·

23、; m i n下 進(jìn)行體外釋放研究。分別于 0 ． 5 ? 124 、 6 、 1 2 、 2 4h 取 樣0 ． 5m l ， 高效液相色譜法測定藥物釋放量 ， 按下列公 式計(jì)算膠束的藥物的釋放百分?jǐn)?shù) 。釋放率 =CtxVm e d i aDo xM - D o x ×1 o 0 ％ M 一 ?其中， C M ． D 。為 M 。 D o x 溶液的濃度，． Ⅱ 。為 M 。 D o x 溶液 的體積 ， C為 t 時(shí)刻釋放

24、介質(zhì) 中阿霉素的濃度 ，幽 為 釋放介質(zhì)的體積。1 ． 4 ． 4 體 內(nèi)分布 采用在 右側(cè)第 四乳腺 墊皮 下接種 4 T 1細(xì)胞 的 B A L B ／ c 雌性小鼠研究膠束的體內(nèi)分布。將處于對數(shù) 生長期的4 T 1 細(xì)胞植入小 鼠右側(cè)第 四乳腺墊皮下 ， 每 鼠接種 l 5 萬細(xì)胞 ， 接種體積為 0 ． 2m l 。當(dāng)腫瘤直徑長 至 0 ． 5～1a m時(shí)將動(dòng)物隨機(jī)分成 F — D o x組、 M。 D o x組 、 M 2 -

25、 D o x 組與 M 3 - D o x 組 4 組 ， 每組 3 6只動(dòng)物。給藥 劑量為 1 0m g · k g 一， 尾靜脈給藥。分別于給藥后 1 、 3 、6 、 1 2 、 2 4 、 4 8h 時(shí)， 取 6只動(dòng)物進(jìn)行眼眶取血， 并在 1 2 、2 4h 時(shí)一并取心、 肝、 脾、 肺、 腎與腫瘤 ， 洗滌 、 稱重后 并勻漿。采用酸性 乙醇 ( 0 ． 3m o l · LH C I ： E t O H

26、=3 ： 7 ， V ： V ) 提取血漿與組織勻漿 中的阿霉素， 采用熒 光分 光光 度法 測定 阿 霉素 濃度 ， 其 中激發(fā) 波 長為 4 8 0n m， 發(fā)射 波長為 5 9 0n m。1 ． 4 ． 5 急性毒性研 究雌性 B A L B ／ c 小鼠按體重隨機(jī)分為生理鹽水對照組、 F — D o x 組、 M一 D o x 組、 M 2 - D o x 組與 M 3 - D o x 組 ， 其 中F - D o x 、 M1

27、 - D o x 、 M 2 - D o x 與 M ： 3 - D ~ x 組按劑距 1 ： 0 ． 7 5分 為 9 ． 5 、 1 2 ． 7 、 1 6 ． 9 、 2 2 ． 5 、 3 0m g · k g5 個(gè)亞劑量組， 每 組 1 0只動(dòng)物 ， 尾靜脈給藥。給藥后連續(xù)觀察 1 4d ， 包 括總體狀況、 體重變化及動(dòng)物存活情況等。1 4d后對 仍存活的低劑量 9 ． 6m g · k g組與高劑量 1

28、 6 ． 9m g ·k g組動(dòng)物眼眶取血進(jìn)行血液生化分析。并取心、 肝、脾 、 肺、 腎組織， 用 4 ％甲醛固定， 石蠟包埋， H E染色后 觀察器官的病理變化。1 ． 4 ． 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù) 據(jù) 以 元4 - _ s表示 ， 采 用 S t a t a統(tǒng) 計(jì)分 析 軟 件 ( 7 ． 0 版) 進(jìn)行方差分析， 藥代動(dòng)力學(xué)采用 3 P 9 7藥代動(dòng) 力學(xué)軟件程序進(jìn)行分析 ， 用 K a p l a n — M e

29、i e r 方法評估動(dòng) 物的存活及 L o g — r a n k ( M a n t e l — C o x ) 檢驗(yàn)生存曲線之間的差別 ， P< 0 ． 0 5為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果與討論 2 ． 1載藥 P E G — P E的制備與表 征 P E G 砌 - P E與阿霉素通過水分散法 以自組裝 的方 法形成阿霉素膠束。動(dòng)態(tài)光散射分析顯示 ： M ， 一 D o x 、M 2 - D o x 與 M 3 - D o

30、x的平均粒徑分別為( 1 4 ． 5± 1 ． 2 ) ( 圖1 A ) 、 ( 2 2 ． 4± 0 ． 9 ) ( 圖 1 B ) 與 ( 3 4 ． 2±1 ． 3 ) n m( 圖1 C ) 。當(dāng)體系 中加入 H S P C時(shí)， 隨著 H S P C用量 的增 加 ， 膠束的粒徑增大。當(dāng)體系中未加入 H S P C時(shí)， 粒子 的形態(tài)呈球形 ( 圖 1 D ) 。當(dāng)體系中 H S P C的摩爾比用 量

31、增加至 3 3 ％ ( M 2 - D o x ) 與 5 0 ％ ( M 3 - D o x ) 時(shí) ， 粒子的 形態(tài)逐漸變?yōu)槿湎x形棒狀結(jié)構(gòu)( 圖 1 E — F ) 。體系中加 入 H S P C后粒子形態(tài)的變化與 H r i s t o v a 等 卜的研究 結(jié)果一致 ， 并且他們采用小角 x射線散射研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)體系中 H S P C的用量低于 5 0 ％( 摩爾比) 時(shí)， 膠束表面 的 P E G分?jǐn)?shù)( 0 ． 7 9 ～ 0