綠色巴夫藻多不飽和脂肪酸合成關(guān)鍵酶基因的克隆表達(dá)及功能研究.pdf

1、多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)是指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵且碳鏈長為16-22個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸，包括二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳六烯酸(DHA)等，其中EPA/DHA.具有重要的生理作用如：營養(yǎng)強(qiáng)化，調(diào)控脂類代謝，預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，調(diào)節(jié)視力和大腦發(fā)育，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，還可以開發(fā)為抗腫瘤藥物。目前，深海魚油是EPA及DHA等PUFA的重要商

2、業(yè)來源，然而僅僅依靠原有的魚油資源已經(jīng)無法滿足日益擴(kuò)大的市場(chǎng)需求。另外，研究發(fā)現(xiàn)，魚類并不是PUFA的真正生產(chǎn)者，而是通過吞食富含PUFA的海洋微藻后在體內(nèi)積累。海洋微藻是EPA/DHA的初級(jí)生產(chǎn)者，而且從微藻中提取PUFA比生產(chǎn)魚油工藝簡單，產(chǎn)品沒有魚腥味，膽固醇含量低。因此，利用海洋微藻生產(chǎn)PUFA成為獲取EPA和DHA的一種新的手段。但是海洋微藻多為自養(yǎng)藻，生長緩慢，細(xì)胞得率低，培養(yǎng)過程中易染雜菌，另外對(duì)微藻的規(guī)模化培養(yǎng)及細(xì)胞改良

3、等方面的研究尚處于實(shí)驗(yàn)室階段，所以利用微藻大規(guī)模提取生產(chǎn)EPA/DHA來滿足社會(huì)需求還不現(xiàn)實(shí)。 PUFA的生物合成始于C18-PUFA：LA和ALA，通過一系列的脂肪酸脫氫酶(fatty acid desaturase，F(xiàn)AD)的脫氫作用和脂肪酸碳鏈延伸酶(fatty aicdelongase，F(xiàn)AE)的碳鏈延伸作用逐步完成。FAD催化的脫氫反應(yīng)是將脂肪酸鏈中的C-C轉(zhuǎn)化為C=C，每個(gè)FAD都在酰基鏈的特定位置引入雙鍵；FAE是

4、參與C18、C22-PUFA的碳鏈延伸反應(yīng)的一類延伸酶復(fù)合體，它催化供體(乙酰輔酶A或丙二酰輔酶A)的兩個(gè)碳原子引入PUFA碳鏈中增加其碳鏈長度。 隨著對(duì)PUFA生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制研究的深入，從分子水平上研究微藻PUFA合成的影響因素，通過對(duì)PUFA合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆，實(shí)現(xiàn)基因的異體高效表達(dá)，以期得到大量的PUFA，為解決EPA/DHA資源，降低生產(chǎn)成本，提供一條新途徑。而且FAD和FAE在植物基因工程，食品工程和發(fā)酵

5、工程等領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景是毋庸置疑的，在上述領(lǐng)域的應(yīng)用也將進(jìn)一步促進(jìn)對(duì)脂肪酸合成途徑的認(rèn)識(shí)和研究。本論文實(shí)驗(yàn)材料綠色巴夫藻(Pavlova viridis)為自養(yǎng)微藻，EPA和DHA含量豐富，分別占總脂含量的16％和9％，是研究脂肪酸合成途徑中相關(guān)脫氫酶和延伸酶很好的實(shí)驗(yàn)材料。本文的工作和研究成果如下： 1.研究了培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度對(duì)P.viridis生長及其EPA/DHA含量的影響，優(yōu)化培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，P.viridis的

6、生長溫度范圍較廣，在16℃～25℃均可生長，但是低溫(18℃)有利于藻體內(nèi)EPA和DHA的積累，經(jīng)氣相色譜分析此條件下的EPA和DHA含量分別為16.25％，9.226％，較25℃條件下提高了12.45％和8.226％。由此證實(shí)：盡管較高的溫度有利于P.viridis的生長，但此時(shí)不飽和脂肪酸含量較低。P. viridis為自養(yǎng)生物，當(dāng)光照強(qiáng)度較弱時(shí)，該藻生長停滯，此時(shí)的EPA和DHA含量較低；隨著光照強(qiáng)度的增加，藻體生長加快，同時(shí)EP

7、A和DHA的含量也增加到16.62％和6.79％。通過GC/MS測(cè)定18℃光照培養(yǎng)條件下P.viridis的脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)P.viridis不飽和脂肪酸種類齊全，含有多種不飽和脂肪酸，是克隆脫氫酶基因和延伸酶基因很好的實(shí)驗(yàn)材料。 2.總RNA的質(zhì)量直接影響到所建文庫的優(yōu)劣，本文在對(duì)比了Trizol試劑法，異硫氰酸胍一步法，CTAB法等方法的基礎(chǔ)上，摸索出一種適用于只P.viridis總RNA提取的有效方法-CTAB和酸酚相結(jié)合

8、的改良CTAB法。此方法可有效去除RNA提取過程中多糖和多酚類物質(zhì)的干擾，所得RNA質(zhì)量較高。利用改良的CTAB法提取P. viridis總RNA，構(gòu)建其cDNA文庫，所建cDNA文庫滴度為6×106pfu/mL，重組率達(dá)到98％，插入片段在250 bp-2.0 kbp之間，表明該文庫達(dá)到建庫要求。通過表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags，ESTs)技術(shù)對(duì)P. viridis cDNA文庫進(jìn)行隨機(jī)序列擴(kuò)增和測(cè)序，

9、將所得200條EST序列與GenBank中已報(bào)道基因進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，獲得了許多功能基因的遺傳信息，為克隆基因全長和進(jìn)一步開發(fā)微藻的新功能基因奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在這200條ESTs序列中參與蛋白質(zhì)合成的基因和參與能量代謝(包括光合作用和呼吸作用)的基因含量比較高，分別占41％和20％。但是通過EST技術(shù)，沒有篩選到脫氫酶基因或者延伸酶基因序列，說明ESTs方法不適用于豐度較低基因的篩選。 3.利用SMART RA

10、CE技術(shù)首次克隆了P.viridis C20-延伸酶基因(elkj)。 利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)作為elkj表達(dá)的報(bào)告基因，將克隆的C20-延伸酶基因(elkj)和GFP基因融合，實(shí)現(xiàn)了elkj在Escherichia coli中的表達(dá)，證實(shí)elkj編碼的蛋白為膜整合蛋白，并且具有C20-延伸酶活性。 elkj基因全長945 bp，編碼314個(gè)氨基酸，推測(cè)蛋白質(zhì)大小為34.5

11、 kDa，經(jīng)TMHMM疏水性預(yù)測(cè)分析，ELKJ蛋白七次穿膜，C末端位于胞內(nèi)且具有雙賴氨酸結(jié)構(gòu)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)。經(jīng)Southern blot分析，elkj基因在P.viridis基因組中為單拷貝。 C20-延伸酶催化EPA合成DPA，是從EPA到DHA合成的關(guān)鍵步驟。經(jīng)過氣相色譜分析大腸桿菌脂肪酸甲酯組成，顯示重組菌E. coli DE3/pwalEL具有催化EPA產(chǎn)生DPA的C20-延伸酶酶活，確認(rèn)了在P.viridis中從EP

12、A到DHA的轉(zhuǎn)化需要兩步合成(two step conversion)。 實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)elkj基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，重組菌E. coliDE3/pwalEL生長較對(duì)照菌株主E. coli DE3/pWaldo-gfpe弱，表明ELKJ的表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生了毒性效應(yīng)，導(dǎo)致表達(dá)困難，無法得到目的蛋白產(chǎn)物。因此，將ELKJ蛋白和GFP蛋白融合表達(dá)，通過觀察GFP的熒光，反映ELKJ的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在激光共聚焦顯微鏡下觀察

13、到重組菌E. coli DE3/pwalEL發(fā)出綠色熒光，說明ELKJ-GFP融合蛋白正確表達(dá)，ELKJ蛋白部分插入細(xì)胞膜中，融合蛋白未形成包涵體；通過測(cè)定全細(xì)胞熒光信號(hào)，對(duì)比不同條件下ELKJ的表達(dá)量，確定ELKJ了蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，利用GFP的自發(fā)熒光可以作為檢測(cè)膜蛋白各種表達(dá)條件的指標(biāo)，為膜蛋白的研究提供了一個(gè)有效的方法，為真核生物膜蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。 4.首次克隆了P.viridis的△4、△5脫氫

14、酶全長基因序列，包括外顯子，內(nèi)含子以及基因的啟動(dòng)子序列。海洋微藻的分子生物學(xué)起步較晚，可供參考的遺傳信息和操作工具很少，在克隆P.viridis脫氫酶基因時(shí)進(jìn)行了廣泛探索，對(duì)構(gòu)建P. viridis cDNA文庫進(jìn)行大量篩選后，沒有得到脫氫酶基因序列，改用SMARTRACE技術(shù)以及SEFA PCR技術(shù)成功擴(kuò)增了△4-脫氫酶基因(phjDes4)和Δ5-脫氫酶基因(pkjDes5)。pkjDes4其開放閱讀框全長1440 bp，編碼479

15、個(gè)氨基酸，提交GenBank獲得accession no.EF486526；pkjDes5其開放閱讀框全長1278 bp，編碼425個(gè)氨基酸，提交GenBank獲得accession no.EF486527。經(jīng)過Southern blot分析，pkjDes4和pkjDes5同C20-elongase基因一樣，在P.viridis基因組中均為單拷貝基因，證實(shí)PUFA合成途徑中的相關(guān)酶基因在基因組中的拷貝數(shù)均較低，利用大量篩選文庫得到目的基

16、因的方法比較困難。 5.利用從P.viridis中克隆的C20-elongase基因elkj和Δ4-desaturase基因pkjDes4，完成了elkj在Pachia pastoris中的表達(dá)及功能驗(yàn)證，并構(gòu)建了elkj和pkjDes4在P.pastoris中的共表達(dá)載體，為利用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)DHA奠定基礎(chǔ)。利用pPIC3.5K整合型載體，構(gòu)建elkj在P.pastoris中的表達(dá)載體pPEL，篩選到高拷貝整合宿主重組菌株G

17、3，經(jīng)氣相色譜分析P. pastoris GS115/pPEL脂肪酸甲酯成分，顯示重組菌G3具有催化EPA產(chǎn)生DPA的C20-elongase酶活，完成了elkj在P.pastoris中的功能驗(yàn)證，為利用P.pastoris構(gòu)建DHA的體外合成途徑奠定基礎(chǔ)。 6.以乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZS148為骨架在C末端融合GFP，首次構(gòu)建了一個(gè)乳酸乳球菌表達(dá)載體pKj-gfp，并利用該載體，實(shí)現(xiàn)了ELKJ在Lactococcus lac

18、tis中的過量表達(dá)。由于NICE系統(tǒng)(NIsin controlled expressionsystem)的嚴(yán)謹(jǐn)性及L.lactis作為宿主表達(dá)膜蛋白的優(yōu)越性，NICE系統(tǒng)被發(fā)展為可控制的膜蛋白質(zhì)表達(dá)的理想系統(tǒng)。通過激光共聚焦顯微鏡觀察nisin(乳鏈菌肽)誘導(dǎo)后L.lactis NZ9000/pKj-el綠色熒光，未發(fā)現(xiàn)不發(fā)熒光細(xì)胞，說明質(zhì)粒在L.lactis中穩(wěn)定性。利用GFP熒光檢測(cè)ELKJ的表達(dá)過程，大大簡化了膜蛋白表達(dá)菌株篩選