聚合卵巢的腎囊移植手術(shù)操作

1、供體細(xì)胞的聚合操作 供體細(xì)胞的聚合操作青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生殖發(fā)育與基因工程研究所陳波 flamingcb@163.com1、在聚合前，先平衡鋪有瓊脂的 30mmα 培養(yǎng)皿：在 α 培養(yǎng)皿中鋪上一層薄薄的瓊脂，待瓊脂凝固后，向其中加入 1ml 含 10% FCS 的 αMEM 培養(yǎng)液，放入 37℃、飽和濕度、5%CO2 培養(yǎng)箱中。如此反復(fù)洗 3 次，每次 15min 以上。2、把待聚合的細(xì)胞混合均勻，轉(zhuǎn)移到 0.5ml 離心管中（注意用 B

2、SA 培養(yǎng)液洗下平皿中剩余的細(xì)胞） ，3500rpm，離心 3min，棄上清。3、加入 400μl BSA 培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞（去除消化液） ，3500rpm，離心3min，棄上清，盡量把上清吸干凈。4、加入 BSA 培養(yǎng)液 100μl 重懸細(xì)胞，加入 0.02g 植物凝集素，使其終濃度為 0.2mg/ml，混勻。37℃、飽和濕度、5%CO2 培養(yǎng)箱平衡 10min，平衡過程中震蕩數(shù)次以利于細(xì)胞充分吸附植物凝集素。5、12000rpm，離

3、心 10s，將離心管旋轉(zhuǎn) 180°，12000rpm，離心 30s。6、取一個(gè) 200ul 槍頭，用刀片傾斜著削去一部分（就像注射器針尖的切面） ，以便能將組織完整吸入而不損傷其結(jié)構(gòu)。把離心管中的組織塊用槍吸到平衡好的 30mm α 培養(yǎng)皿中，加入適量含 10% FCS 的 αMEM 培養(yǎng)液，在保證組織不至于懸浮在培養(yǎng)液中的前提下盡量多加一些——這點(diǎn)很重要！將培養(yǎng)皿倒置放入 37℃、飽和濕度、5%CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。7、培養(yǎng)

4、24h 后的聚合卵巢會開始漸漸聚攏，形成圓餅狀；培養(yǎng) 48h 后的聚合卵巢則形成圓球形，明顯高出培養(yǎng)液液面，邊緣形成清晰的界面，用鑷子可以反復(fù)夾起而不變形。聚合的卵巢一定要培養(yǎng)到供體有穩(wěn)定的形狀后再移植，否則在腎包囊的壓力下供體會被壓扁而無法成團(tuán)，也就無法支持卵泡發(fā)生（這是血的教訓(xùn)）?。?！8、聚合出的組織不能超過 2mm3，否則營養(yǎng)無法輸送到組織內(nèi)部，在供體與受體建立起新的血管聯(lián)系之前，供體內(nèi)部會壞死！聚合卵巢的腎囊移植手術(shù)操作 聚合卵

5、巢的腎囊移植手術(shù)操作青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生殖發(fā)育與基因工程研究所陳波 flamingcb@163.com1、選取 8-12 周大，體型適中，反應(yīng)敏捷，正常發(fā)情且未合籠的健康母鼠作為受體。周齡偏小的小鼠其腎囊較脆弱，不利于植入操作。 周齡偏小的小鼠其腎囊較脆弱，不利于植入操作。2、根據(jù)小鼠的體重，腹腔注射 6mg/ml 的戊巴比妥鈉麻醉劑使小鼠麻醉，麻醉劑的用量為 0.85mg/10g 體重（一般為 410ul-430ul，不會超過 500u

6、l） 。使用 使用avertin 做麻醉劑時(shí)：成年 做麻醉劑時(shí)：成年 CD-1 母鼠用量為 母鼠用量為 520ul 左右；成年 左右；成年 CD-1 公鼠為 公鼠為 1ml左右； 左右；SCID Beige 鼠用量在 鼠用量在 410 左右。 左右。注射手法見下圖：麻醉后有必要對麻醉效果進(jìn)行評價(jià)：? 如果給小鼠剪毛和剪開皮膚時(shí)不會劇烈反抗（輕微放抗是正常的） ，眼睛、腳掌和尾巴血色充盈，則視為麻醉效果較好；? 如果麻醉效果不好，可視具體

7、情況追加麻醉劑，補(bǔ)加麻醉劑最好在剪開腹膜之前進(jìn)行；? 如果麻醉過度，則小鼠毫不反抗，并且全身血色漸漸退去，眼睛、腳掌和尾巴漸漸發(fā)暗，則視為麻醉過度，應(yīng)放棄該受體，重新麻醉；? 如果麻醉后或手術(shù)過程中，小鼠呼吸困難（此時(shí)會做幾次連續(xù)深度呼吸） 、呼吸停止或排尿，則受體即將死亡。3、用酒精濕潤小鼠背側(cè)皮膚，以術(shù)剪減去小鼠背側(cè)毛，范圍為距切口周圍1cm 為宜。4、在小鼠背側(cè)中線與卵巢大概所處位置的水平線的交點(diǎn)處，沿脊柱由下至上縱向剪開一個(gè) 1