指狀青霉DSM 62840轉化檸檬烯為α-松油醇的微生物轉化研究.pdf

1、檸檬烯是一種重要的功能性單萜，在食品中作為香精香料添加劑被廣泛使用，其含氧衍生物具更高經濟價值。與傳統(tǒng)化學方法相比，微生物轉化反應條件溫和，區(qū)域和立體選擇性好，環(huán)境友好且獲得的為“天然”產品。通過微生物轉化，可以將檸檬烯轉化為香氣更濃，應用更為廣泛的、商業(yè)價值更高的香芹醇、香芹酮、紫蘇酸、α-松油醇等物質。本實驗先利用SPME-GC-MS，分析檢測了三株真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum CICC41029)、指狀青霉（

2、Penicillium digitatum DSM62840）并口青霉（Penicillium sp.）對檸檬烯的轉化產物，以α-松油醇為目標產物，根據(jù)各個菌株微生物轉化產物的種類和含量，選出最優(yōu)轉化菌株;然后對指狀青霉（Penicilliumdigitatum DSM62840）轉化檸檬烯為α-松油醇的過程進行條件優(yōu)化并對轉化過程中的酶進行了初步研究;最后采用iTRAQ技術對指狀青霉(Penicillium digitatumDSM6

3、2840)對檸檬烯微生物轉化不同時期(12h和0h)的蛋白表達做了比較，鑒定得到的差異蛋白為深入研究指狀青霉（Penicillium digitatum DSM62840）對檸檬烯微生物轉化的分子機制提供基礎。本研究主要內容包括：
　?、疟容^三株真菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum CICC41029）、指狀青霉（Penicillium digitatum DSM62840）和青霉（Penicillium sp.）

4、生物轉化檸檬烯的產物，利用SPME-GC-MS固相微萃取-氣相色譜-質譜連用的方法對發(fā)酵液進行檢測，總共得到13種轉化產物，其中薄荷烯酮、異薄荷烯酮、異佛爾酮為尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum CICC41029）所獨有的產物，紫蘇醇、紫蘇醛為青霉（Penicillium sp.）所獨有的產物，γ-松油烯、α-異松油烯、α-松油醇為指狀青霉（Penicillium digitatumDSM62840）所獨有的產物;1-對薄

5、荷烯-9-醛為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumCICC41029）和青霉（Penicillium sp.）所共有的產物，脫氫香芹酮、香芹醇為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum CICC41029）和指狀青霉（Penicillium digitatumDSM62840）所共有的產物，1，3，8-p-Menthatriene為青霉（Penicillium sp.）和指狀青霉（Penicillium digita

6、tum DSM62840）所共有的產物;3株真菌均能在檸檬烯2位進行氧化得到香芹酮。指狀青霉（Penicillium digitatum DSM62840）可以在24h時生成202±14.7mg/L的α-松油醇，表現(xiàn)出良好的轉化檸檬烯的能力。
　?、茖χ笭钋嗝梗≒enicillium digitatum DSM62840）轉化檸檬烯為α-松油醇的過程進行條件優(yōu)化，分別研究不同指狀青霉生長時期、底物濃度、共溶劑種類、溫度、pH、轉速

7、等因素，得出最優(yōu)轉化條件，即在搖瓶培養(yǎng)中，先預培48小時，再加入20％的檸檬烯/乙醇溶液（檸檬烯終濃度為840mg/L），于24℃，150 rpm和pH6.0條件下轉化12 h。該條件下得到的α-松油醇濃度為833.93±18.67 mg/L，是優(yōu)化之前（202±14.7mg/L）的4.1倍。實驗顯示該生物轉化對溫度和pH有較好的耐受性，8-32℃，pH5-8對生物轉化的影響均不大。
　?、菍χ笭钋嗝梗≒enicillium di

8、gitatum DSM62840）轉化檸檬烯為α-松油醇的微生物轉化過程中的酶進行了初步研究，實驗結果表明負責該生物轉化的酶系具有對映體選擇性，即P.digitatum DSM62840不能將S-(-)-檸檬烯轉化為S-（-）-α-松油醇，只能將R-(+)-檸檬烯轉化為R-(+)-α-松油醇;該生物轉化過程中的酶是可誘導的，當在指狀青霉（Penicillium digitatum DSM62840）24小時預培養(yǎng)物中加入低劑量(84mg

9、/L)的R-(+)-檸檬烯進行誘導時，α-松油醇的濃度提高50％;加入氧化酶抑制劑鄰二氮雜菲和8-羥基喹啉后該生物反應均被抑制，說明該生物轉化酶系可能為細胞色素P-450單加氧酶。
　　⑷為了初步探討指狀青霉（Penicillium digitatum DSM62840）對檸檬烯微生物轉化的機制，本研究采用iTRAQ技術對指狀青霉檸檬烯微生物轉化不同時期(12h和0h)的蛋白表達做了比較，共鑒定得到20373個肽段，3644個蛋白