木素過(guò)氧化物酶對(duì)疏水性芳香化合物的高效降解及機(jī)制研究.pdf

1、木素是自然界中僅次于纖維素的第二大有機(jī)碳源。木素的降解已構(gòu)成自然界碳素循環(huán)的限速步驟。白腐菌是自然界中唯一能夠徹底降解木素的微生物，黃孢原毛平革菌是其典型菌種。白腐菌降解木素主要依靠細(xì)胞分泌的木素降解酶系，其中木素過(guò)氧化物酶(LiP)是最重要的一種。藜蘆醇(VA)是白腐菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，也是LiP的生理底物。有關(guān)藜蘆醇在木素降解中的作用多年來(lái)一直是學(xué)術(shù)界爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。白腐菌降解木素主要是過(guò)氧化物酶參與的自由基氧化過(guò)程，這種獨(dú)特的自由基氧化

2、機(jī)制引起了環(huán)境科學(xué)工作者的關(guān)注。1985年，Bumpus等首次報(bào)道純培養(yǎng)的黃孢原毛平革菌能降解多環(huán)芳烴化合物，此后，利用白腐菌降解環(huán)境污染物的研究成了環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域里的研究熱點(diǎn)。 本論文以黃孢原毛平革菌分泌的具有高氧化性能的LiP酶為氧化劑，酚型或非酚型芳香化合物為模型化合物，通過(guò)H2O2酶法緩釋、反膠束中LiP活力的介質(zhì)調(diào)控以及添加電子介體等手段和方法提高了LiP對(duì)疏水性芳香化合物的降解效率，闡明了不同介質(zhì)中VA介導(dǎo)LiP催化

3、氧化芳香化合物的介導(dǎo)機(jī)制。上述一系列較為系統(tǒng)深入的工作對(duì)于提高疏水性污染物的LiP酶解效率、進(jìn)一步弄清VA在白腐菌降解木素過(guò)程中的作用與機(jī)制等具有十分重要的意義。 本論文的具體研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下： 一. 通過(guò)雙酶耦聯(lián)及介質(zhì)調(diào)控實(shí)現(xiàn)疏水性芳香化合物的高效降解1.葡萄糖氧化酶與LiP耦聯(lián)，使H2O2緩釋?zhuān)瑢?shí)現(xiàn)芳香染料的高效降解H2O2的提供方式是影響LiP對(duì)污染物降解效率的關(guān)鍵因素之一。在本文中，我們用葡萄糖氧化酶催化氧

4、化葡萄糖來(lái)產(chǎn)生和控制H2O2，并將之與LiP催化氧化芳香化合物的反應(yīng)相耦合。通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH及葡萄糖氧化酶的加入量可以方便的控制體系H2O2的生成速率。由于H2O2緩釋?zhuān)苊饬艘淮涡约尤際2O2時(shí)H2O2對(duì)LiP的失活現(xiàn)象，從而使LiP在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持較高的催化活力。芳香染料降解實(shí)驗(yàn)表明酶法H2O2緩釋的方法可以明顯提高LiP對(duì)芳香染料的降解效率。 2.介質(zhì)調(diào)控LiP高效降解疏水性芳香化合物研究疏水性芳香化合物在水中溶解度很小，而

5、LiP是水溶性酶，因此水介質(zhì)中LiP降解疏水性芳香化合物的效率低。反膠束可以提高疏水性芳香化合物的溶解度，而且LiP在反膠束中也可以保持一定的催化活力，因此用反膠束介質(zhì)代替水介質(zhì)應(yīng)該可以提高LiP對(duì)疏水性芳香化合物的降解效率。反膠束介質(zhì)中疏水性芳香化合物的降解效率取決于LiP在反膠束中的活力及H2O2的含量。在先前工作基礎(chǔ)上，通過(guò)一定量的AOT與Brij30復(fù)配，形成了一種新的AOT/Brij30反膠束體系。該體系克服了傳統(tǒng)的單一表面活

6、性劑體系低LiP活力的缺點(diǎn)，通過(guò)反膠束介質(zhì)電性質(zhì)及反膠束大小等條件優(yōu)化，獲得了AOT/Brij30反膠束中高的LiP活力。高濃度的H2O2對(duì)LiP的催化活力起抑制作用，而且反膠束介質(zhì)中這種抑制作用更加突出。鑒于這種情況，我們將前文的酶法H2O2緩釋方法移植到AOT/Brij30反膠束體系中，進(jìn)一步改善了LiP在反膠束中的催化活力。三苯甲烷類(lèi)染料降解實(shí)驗(yàn)表明在.AOT/Brij30反膠束體系中，用GOD/LiP雙酶耦聯(lián)的方式可以顯著提高染

7、料的降解效率，為反膠束介質(zhì)中疏水性芳香化合物的LiP酶轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。 二. 不同介質(zhì)中，VA介導(dǎo)LiP催化氧化芳香化合物反應(yīng)的雙底物機(jī)制1.水介質(zhì)中H2O2調(diào)控VA介導(dǎo)LiP催化氧化鄰苯三酚紅(PR)反應(yīng)研究LiP催化H2O2氧化鄰苯三酚紅(PR)反應(yīng)的氧化產(chǎn)物受H2O2與PR的摩爾比控制，H2O2與PR的摩爾比不同，所得降解產(chǎn)物不一樣。分析表明，H2O2在LiP催化氧化PR過(guò)程中的雙重作用(即低濃度的H2O2是LiP的激活

8、劑，高濃度的H2O2是LiP的抑制劑)是導(dǎo)致上述現(xiàn)象的根本原因。藜蘆醇(VA)對(duì)LiP催化氧化PR的反應(yīng)有促進(jìn)作用，尤其是當(dāng)H2O2與PR的摩爾比較高時(shí)這種促進(jìn)作用更為明顯；然而PR對(duì)LiP催化氧化VA的反應(yīng)卻有抑制作用。后者可以用來(lái)解釋為什么在用白腐菌降解染料時(shí)在培養(yǎng)液中常常檢測(cè)不到LiP的藜蘆醇活力。分析表明，VA的存在不但促進(jìn)了LiP酶中間體Lip(Ⅱ)和/或LiP(Ⅲ)向LiP的轉(zhuǎn)化，使LiP的催化循環(huán)加速，VA生成的VA+-也

9、間接氧化了染料PR，從而使PR的氧化速率提高。 2.反膠束介質(zhì)中VA介導(dǎo)LiP催化氧化PR反應(yīng)的機(jī)制白腐菌降解木素及環(huán)境污染物是在與本體水差別盛大的膠體介質(zhì)中進(jìn)行的，反膠束更接近LiP的天然環(huán)境，因此反膠束介質(zhì)中VA介導(dǎo)LiP催化氧化反應(yīng)機(jī)制的研究將更有助于闡明VA在木素及環(huán)境污染物降解中的作用。AOT/Brij30反膠束中VA介導(dǎo)LiP催化氧化PR反應(yīng)機(jī)制的研究表明：反膠束介質(zhì)中VA對(duì)LiP催化氧化PR的反應(yīng)有促進(jìn)作用，即使是在低H2

10、O2濃度下。此外，VA的促進(jìn)作用隨VA濃度的增大而增大，直至最大值。對(duì)一系列設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果的綜合分析表明，與水介質(zhì)中不同，反膠束介質(zhì)中VA對(duì)LiP催化氧化PR反應(yīng)的促進(jìn)作用主要是VA+-對(duì)pR的間接氧化作用，VA對(duì)LiP的保護(hù)作用并不顯著。 3.介質(zhì)對(duì)VA+-壽命的影響VA+-自由基的壽命是闡明VA在木素降解初始過(guò)程中的作用的關(guān)鍵，也是闡明VA介導(dǎo)LiP催化氧化芳香化合物反應(yīng)機(jī)制的關(guān)鍵。以往關(guān)于VA+-自由基壽命的研究都是在

11、水介質(zhì)中進(jìn)行的，而LiP的天然環(huán)境與水介質(zhì)差別盛大。不同介質(zhì)中VA+-的壽命應(yīng)該是不一樣了。因此，在這一部分工作中，我們研究了介質(zhì)對(duì)幾種自由基壽命的影響。結(jié)果表明，與水介質(zhì)中相比，反膠束介質(zhì)中自由基的壽命均明顯變長(zhǎng)，且變化的程度與自由基的結(jié)構(gòu)有關(guān)。以苯酚陽(yáng)離子自由基為例，水介質(zhì)與反膠束介質(zhì)中，苯酚自由基的衰減動(dòng)力學(xué)常數(shù)分別為Kaquenous medium=0.023s-1，Kreversed micelles=5.8×10-3 s-1

12、。反膠束介質(zhì)介電常數(shù)的減小有可能是導(dǎo)致陽(yáng)離子自由基衰減變慢的主要原因。LiP活性中間體而非LiP可以穩(wěn)定陽(yáng)離子自由基，延長(zhǎng)自由基壽命。 三. 色氨酸對(duì)LiP催化氧化芳香化合物的促進(jìn)作用色氨酸(TRP)對(duì)LiP催化氧化芳香化合物的促進(jìn)作用與芳香化合物的氧化還原電位有關(guān)。對(duì)于氧化還原電位高于TRP的物質(zhì)，TRP對(duì)其酶促反應(yīng)有抑制作用；而對(duì)氧化還原電位低于TRP的物質(zhì)，TRP則可以促進(jìn)其氧化。以PR為模型化合物，我們研究了TRP促進(jìn)