魚類主要過敏原小清蛋白的單克隆抗體制備及其金磁酶聯(lián)免疫體系的構建.pdf

1、魚類及其制品含有豐富的營養(yǎng)，同時也是FAO及WHO認定的導致人類過敏的八大類食物之一。其中魚肉中的小清蛋白（parvalbumin，PV）被視為主要的過敏原，因此開展針對魚類及其制品中小清蛋白強特異性、高靈敏度的檢測具有重要的理論和現(xiàn)實意義。
　　本文研究主要包括小清蛋白單克隆抗體的制備及鑒定、金磁復合納米微粒與酶標抗原的制備以及小清蛋白金磁酶聯(lián)免疫檢測方法的建立。具體研究內容如下：
　　魚類主要過敏原小清蛋白的制備

2、　　使用硫酸銨分級沉淀法，從新鮮的鯽魚魚肉中提取、純化過敏原小清蛋白，經SDS-PAGE凝膠電泳表征過敏原小清蛋白的純度，最后凍干樣品后保存于-20℃冰箱備用。
　　2、小清蛋白單克隆抗體的制備
　　以高純度的PV免疫4只BALB/c小鼠，利用間接ELISA方法測小鼠抗血清效價，獲取效價最高的小鼠（PV效價為1：256000）。取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合，獲得雜交瘤細胞。間接ELISA方法篩選陽性孔

3、，有限稀釋法進行3次亞克隆得到分泌同質的雜交瘤細胞株。采用小鼠體內誘生腹水法大量制備單抗。
　　3、小清蛋白單克隆抗體的鑒定
　　采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化單抗腹水，SDS-PAGE凝膠電泳表征單克隆抗體純度，并采用Western-blotting、考馬斯亮藍染色法分別檢測單抗特異性及抗體濃度，結果顯示 PV單克隆抗體具備良好的特異性，并且單抗?jié)舛葹?00ug/mL，最后通過商業(yè)化試劑盒檢測PV單抗亞類為IgG1型。

4、　　4、金磁（Fe3O4/Au)復合微粒與酶標抗原的制備
　　采用一鍋法制備氨基化的磁性微粒Fe3O4-PEI，之后在其表面包覆兩層Au顆粒，制備金磁（Fe3O4/Au)復合微粒，金磁復合微粒形貌呈圓形，粒徑均一，粒徑約150nm。采用過碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶（HRP）標記PV，用于后面金磁酶聯(lián)免疫體系的建立。
　　5、金磁酶聯(lián)免疫法檢測過敏原小清蛋白體系的建立
　　按照最佳條件制備得到金磁免疫探針和PV酶標抗原后

5、，將它們與PV標準溶液競爭結合建立金磁酶聯(lián)免疫檢測體系，初步探究了該體系在魚類及其制品中檢測小清蛋白的可行性。研究結果顯示PV濃度5.5-289ng/ml范圍內，PV濃度對數(shù)與抑制率有良好的線性關系，標準曲線為y=34.96x-6.0357，R2=0.9979；IC50為40.1ng/mL，LOD為2.8ng/mL。此外，對該檢測體系進行方法學評價，包括精密度、特異性、穩(wěn)定性。結果顯示該方法對PV檢測的批內變異系數(shù)在4.3％-9.6%之